Generering av fluorescerande protein Fusioner i<em> Candida</em> Arter

Summary

PCR-medierad gen modifiering kan användas för att generera fluorescerande proteinfusioner i Candida species, vilket underlättar visualisering och kvantifiering av jästceller och proteiner. Häri presenterar vi en strategi för att konstruera ett fluorescerande protein fusion (Eno1-FP) i Candida parapsilosis.

Abstract

Candida-arter, förhärskande kolonisatörer av tarm och urogenitala regionerna, är orsaken till de flesta av invasiva svampinfektioner hos människor. Således, är molekylära och genetiska verktyg som behövs för att underlätta studier av deras patogenes mekanismer. PCR-medierad gen modifiering är en enkel och snabb metod för att generera epitopmärkta proteiner för att underlätta deras detektering. I synnerhet fluorescerande protein (FP) -fusioner är kraftfulla verktyg som tillåter visualisering och kvantifiering av både jästceller och proteiner genom fluorescensmikroskopi och immunoblotting, respektive. Plasmider innehållande FP-kodande sekvenser, tillsammans med närings-markörgener som underlättar omvandlingen av Candida arter, har genererats i syfte att FP konstruktion och expression i Candida. Häri presenterar vi en strategi för att konstruera en FP fusion i en Candida-arter. Plasmider innehållande nourseothricin tåligiou transformation markörgen (NAT1) tillsammans med sekvenser för antingen grönt, gult eller körsbärs bps (GFP, YFP, mCherry) används tillsammans med primrar som inkluderar genspecifika sekvenser i en polymeraskedjereaktion (PCR) för att generera en FP kassett . Denna gen specifika kassetten har förmåga att integrera sig i 3'-änden av den motsvarande genlocus via homolog rekombination. Framgångsrik i-ram fusion av FP-sekvensen in i genlocus av intresse verifieras genetiskt, följt av analys av fusionsprotein-expression genom mikroskopi och / eller metoder immuno-detektion. Dessutom, för fallet med höggradigt uttryckta proteiner, framgångsrika fusioner kan screenas för i första hand genom fluorescensavbildningstekniker.

Introduction

Candida-arter är kommen svampar som koloniserar tarm och urogenitala skrifter av alla människor. Under förhållanden med nedsatt immunförsvar, såsom att inträffa med för tidig födsel eller immunsuppressiva effekter från behandlingar för cancer, kan Candida arter bli opportunistiska patogener. Av Candida arter, är Candida albicans den vanligaste svamp kolonisatör och orsakar majoriteten av invasiva svampinfektioner. Andra Candida arter såsom C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis och C. kruseii också orsaka allvarliga infektioner i patienter med nedsatt immunförsvar, med några uppvisar inneboende resistens mot vanligen använda anti-svamp antibiotika såsom flukonazol och amfotericin B. Därför infektioner med några av dessa arter följs oftare, särskilt hos patienter som behandlas profylaktiskt med antisvampmedel. Även med lämplig och snabb enNTI-svamp behandling, invasiva Candida infektioner fortsätter att förknippas med betydande morbiditet och mortalitet ^1. På grund av betydelsen av Candida arter i människors hälsa, det finns ett behov av lättillgängliga molekylära verktyg som gör det möjligt att studera och klarlägga deras patogenes mekanismer.

Ett viktigt verktyg som gör det möjligt för forskarna att visualisera och kvantifiera mikrobiella celler och proteiner som de uttrycker är FP fusionsteknik. Polymeraskedjereaktion (PCR) -medierad genmodifiering, som beskrivs i detta dokument tillåter byggandet av fusioner mellan FP-sekvenser och en Candida proteinkodande sekvensen av intresse vid dess iska locus. Stabil integrering av konstruktionen underlättar analys av proteinuttryck samt proteinlokaliseringsdynamik. Plasmider innehållande FP-sekvenser, optimerad för uttryck i Candida albicans och som kan användas i PCR-medierad gene modifiering strategi, har tidigare konstruerats ^{2, 3, 4, 5.} Plasmider innehåller FP transformations "kassetter": en FP-sekvens kopplad till en närings markörgen som underlättar omvandlingen av C. albicans och C. parapsilosis ^{2, 3, 4, 5, 6, 7.} Närvarande tillgängliga plasmider innehåller en mängd olika selekterbara näringsmarkörgener (URA3, HIS1, ARG4) för transformation av auxotrofa stammar samt en dominerande läkemedelsresistensmarkör (NAT1), vilket underlättar omvandlingen av kliniska stammar som saknar auxotrophies. Dessutom plasmider innehåller alternativ för upp till fyra olika FP sekvenser (grön [GFP], yellow [YFP], cyan [GFP], och körsbär [mCherry]) och antingen en ADH1-termineringssekvens för konstruktion av karboxiterminus proteinfusioner, eller en promotorsekvens för konstruktion av amino-terminala proteinfusioner. Primrar är utformade med homologi med den plasmid-DNA som omger FP kassetten. Dessutom primers innehåller också 5'-förlängningssekvenser som bär homologi med jäst genen av intresse märkas, vilket underlättar integrering av kassetten i iska locus via homolog rekombination (figur 1). Genspecifika FP kassetter genereras med PCR och sedan omvandlas till Candida-celler som gjorts kompetenta för upptag av DNA genom behandling med litium-acetat.

Figur 1: Diagram över hur FP sekvensfusioner genereras i Candida. (A) Plasmid-DNA includes en FP-sekvens och en sekvens som kodar nourseothricin resistens (NAT1). Relativa lägen i Forward (FWD) och bakåt (REV) primers visas med svarta delar av primers indikerar regionen av homologi med plasmiden sekvens och lila delarna betecknar den genspecifika homologi region eller primerförlängning. (B) FP kassetter förvandlas till Candida och integrera i ENO1 iska locus via homolog rekombination (streckade linjer). (C), vilket gav FP fusionssekvensen vid 3'-änden av ENO1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Häri presenterar vi ett exempel på proteinfusion (Eno1-FP) konstruktioner i Candida. Vi använder märkning plasmider innehållande NAT1 omvandling markörgen tillsammans med sekvenser som kodar för GFP, YFP, ellermCherry (Figur 2). Dessa plasmider används tillsammans med primrar i PCR för att generera genspecifika kassetter som underlättar fusion av ramprogrammen till 3'-änden av ENO1, vilket resulterar i expression av Eno1 fuserad till FP vid dess karboxiterminus.

Figur 2: Kartor över FP kassettinnehållande plasmider. Framåt (F) och reverse (R) primrar som användes för att generera kassetterna från plasmiderna indikeras tillsammans med det relativa läget för deras homologi till plasmiderna. Primersekvenser är såsom anges i tabell 1. F1 och R1 användes också för att generera pYFP- NAT1 kassetten. Plasmiden innehållande YFP- NAT1 kassetten (pMG2263) är identisk med pMG2120 med undantag för YFP i stället för den GFP-sekvensen. Kassettstorlekar: GFP-NAT1, 3,7 kbp; mCherry- NAT1, 3,2 kbp; YFP- NAT1, 3.7 kbp. Denna siffra har modifierats Gerami-Nejad, et al. ⁴ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. Koppla mall plasmider från E. coli Växer E. coli innehållande mallen plasmiden över natten i 10 ml lysogeni buljong (LB) + 200 mg / L ampicillin (AMP) vid 37 ° C med skakning. Harvest cellerna genom centrifugering vid 6000 xg under 2 min. Dekantera vätskan, isolera och rena DNA från E. coli-celler medelst en standardmetod såsom beskrivits tidigare i Ausubel et al. 8. Resuspendera DNA i Tris-EDTA (TE; 10 mM Tri…

Representative Results

Som ett exempel har vi använt det protokoll som beskrivits ovan för att konstruera GFP och mCherry fusioner till Eno1 i en C. parapsilosis laboratoriestam. Varje förmodade trans ursprungligen ströks för tillväxt. I det här exemplet, eftersom den resulterande fusionsproteinet uttrycks kraftigt (enolas) och FPS är ljusa, kunde vi screena transformanter genom fluorescensmikroskopi före utföra diagnostisk PCR (Figur 3) 6. <p cla…

Discussion

Konstruktion av epitopmärkt sekvenser i Candida-arter med hjälp av PCR-medierad genmodifiering strategi som beskrivs ovan kan sammanfattas som en process i tre steg. Först görs en kassett tillverkad genom PCR som kodar både den önskade för integrering och regioner homologa med den geometriska orten för insättning i jästgenomet sekvensen. För det andra är de jästceller som skall transforme göras kemiskt kompetenta med litiumacetat och saminkuberades med kassetten. Tredje cellerna ströks ut på sel…

Materials

100W mercury lamp	CHIU Technical Corporation	M-100T
95% Ethanol	Any	NA
Adenine	Any	NA
Ampicillin	Any	NA
Carrier DNA	Ambion	AM9680	Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml
CCD Camera	Photometrics	CoolSNAP HQ
Conical Tube	Corning	430828	50ml
Culture Tube Rotator	New Brunswick	2013923	TC-8, or Any Culture Tube Rotator
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade	Any	NA
Eppendorf Tubes	Eppendorf	022363719, 022363212	0.5ml, 1.5ml
Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	7250089	125ml
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Any	NA
Freezer (-80 °C )	Thermo Electron Corporation	ULT-1386-9-V	Revco Ultima II
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets	Chroma Technology Corporation	49002, 86004v2, 49008
Glass culture tubes	Fisher Scientific	1496126	75mm
HRP goat anti-mouse antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2005
HRP goat anti-rabbit antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2301
Incubator (30 °C )	Any	NA
Lithium Acetate	Any	NA
Lysogeny Broth (LB) Media	Any	NA
Magnesium Chloride	Any	NA
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Microscope	Nikon	E600	Nikon Eclipse E600
Microscope Image Analysis Software	Universal Imaging Corporation	6.3r7	MetaMorph Software Series 6.3r7
Mouse anti-GFP antibody	Roche	11814460001
Nourseothricin	Fisher Scientific	50997939
PCR Thermocycler	Applied Biosystems	9700	GeneAmp PCR System
PCR tubes	BioExpress, GeneMate	T-3035-1	0.2ml
Polyethylene Glycol 3350	Any	NA
Potassium Chloride	Any	NA
Rabbit anti-mCherry antibody	BioVision	5993-100
Refrigerator (4°C)	Any	NA
Sodium Acetate	Any	NA
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1500
Table Top Centrifuge	Labnet	Z 400	Hermle Z 400
Taq DNA Polymerase	Any	NA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Any	NA
Vortex Mixer	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media	Any	NA