Modeling Kræft i æggestokkene flercellede Sfæroide Behavior i en dynamisk 3D Peritoneal Microdevice

Summary

At studere i æggestokkene tumor progression i en fysiologisk relevant model, flercellede spheroids blev dyrket i en microdevice under simuleret væske flow. Denne dynamiske 3D-model emulerer intraperitoneal miljø med de cellulære og mekaniske komponenter, hvor kræft i æggestokkene metastaser forekommer.

Abstract

Kræft i æggestokkene er karakteriseret ved omfattende peritoneal metastaser, med tumor kugler almindeligvis findes i de maligne ascites. Dette er forbundet med dårlige kliniske resultater og mangler i øjeblikket effektiv behandling. Både det tredimensionale (3D) miljø og de dynamiske mekaniske kræfter er meget vigtige faktorer i denne metastatiske kaskade. De traditionelle cellekulturer undlader at rekapitulere denne naturlige tumormikromiljøet. Således in vivo-lignende modeller, der kan efterligne den intraperitoneale miljø er af indlysende betydning. I denne undersøgelse blev en ny mikrofluid platform i bughinden sat op til at efterligne situationen for ovariecancer sfæroider i bughulen under metastase. Ovariecancer sfæroider fremkommet under en ikke-klæbende tilstand blev dyrket i mikrofluidkanaler overtrukket med peritoneale mesotelceller underkastet fysiologisk relevant forskydningsspænding. Sammenfattende denne dynamiske 3D ovariecancer-mesothelium microfluidic platform kan give ny viden om grundlæggende kræft biologi og fungere som en platform for potentiel screening og udvikling af lægemidler.

Introduction

Kræft i æggestokkene er den mest dødelige gynækologiske kræft og er kendetegnet ved udbredt peritoneal formidling og dannelsen af maligne ascites ^1. Denne omfattende peritoneal metastase er en stor klinisk udfordring og er forbundet med dårlige kliniske resultater. Modsætning til de fleste faste karcinomer, der metastaserer via blodet, ovariecancer formidler primært inden bughulen. Tumorceller eksistere som multicellulære aggregater / sfæroider under processen med metastase ^2. Den omstændighed, at suspensionskultur kan berige ovariecancer spindel / tumor-initierende celler foreslår endvidere, at disse sfæroider kan være forbundet med både tumor aggressivitet og forbedret kemoresistens ^{3, 4.} Der er forskelle i lægemiddelrespons mellem 2D- og 3D kulturer, hvilket formentlig har forskellige molekylære mekanismer ^5.

_content "> Det væsentlige interaktion med mesothelium konstruerer den primære mikromiljø for ovariecancer tumorprogression. Disse mesotelceller ligge på en ekstracellulær matrix (ECM), hvor fibronectin er et allestedsnærværende bestanddel. En forbindelse mellem forøget ekspression af mesotelial celleafledt fibronectin og tumorprogression er blevet vist. fibronectin findes i stort omfang i malign ascites ^{6, 7.} Æggestokkræftceller er også i stand til at inducere sekretion af fibronectin fra mesotelceller for at fremme tidlig ovariecancer metastase ^8.

Ny dokumentation viser, at mekaniske stimuli, herunder forskydningsspænding, kan modulere cellemorfologi, genekspression, og dermed de fænotyper af tumorceller ^{9, 10, 11.} Som malign ascites udvikle og akkumulerer gennem tumor progression, er ovarietumorceller udsat for fluidstrøm og den resulterende forskydningsspænding. Et antal grupper, vores inkluderet, har vist virkningen af forskydningsspænding på ovariecancer progression, herunder cytoskeleton modifikationer, epithelial-til-mesenchymale overgange og cancer stemness ^{12, 13, 14, 15.} Således er en fysiologisk relevant mikromiljø er vigtigt for undersøgelse af tumor peritoneal metastaser. De nuværende in vitro hydrodynamiske dyrkningssystemer har begrænsninger på at efterligne og styring af en konstant, lav, fysiologisk relevant forskydningsspænding ^{16, 17, 18, 19.} Konventionel in vitro metoder fokuserer på enten celle- eller mekaniske miljø er stadig begrænset iefterligne kompleksiteten af ​​intraperitoneal mikromiljø med ordentlig fysiologiske relevans.

Her, med henblik på at konstruere en ny model for peritoneum at overvinde begrænsningerne ved konventionelle strategier og fremme studiet af intraperitoneal rum i cancermetastase, blev et 3D mikrofluidanordning-baseret platform med styret fluidstrømning designet. I denne model, ovariecancer sfæroider blev co-dyrket med primære humane peritoneale mesoteliale celler i mikrofluide chips under kontinuerlig strømningsteknisk flow (figur 1A). Mesothelial celler blev udpladet på fibronectin. Ikke-adhærente ovariecancer sfæroider blev podet i mikrofluidkanaler med kontinuerligt flow medium perfunderet ved en sprøjtepumpe. Både 3D-miljø og de dynamiske mekaniske kræfter er meget vigtige faktorer i den metastatiske kaskade. Denne platform kan anvendes til undersøgelse af intraperitoneal mikromiljø i form af komplekse cellastet, og co-kultur interaktioner, samt med hensyn til dynamiske mekaniske signaler.

Protocol

1. Design og Fabrication mikrofluidapparat Mikrofluid mester design Design og tegne mikrofluid kanal mønster med enhver computer-aided design (CAD) software. BEMÆRK: Normalt CAD-tegning kan sendes til en fotomaske selskab til at producere fotomasken. Mikrofluid design består af tre identiske parallelle kanaler, hver med følgende dimensioner: 4 mm × 25 mm x 250 um (bredde x længde x højde) og sæt 2 mm fra hinanden. Begge kanal ender blev designet med 127 ° vinkler for at lette flydende…

Representative Results

Ved hjælp af denne protokol blev en mikrofluid platform sat op til at modellere ovariecancer sfæroider med mesothelial celler under hydrodynamiske forhold. Primære humane peritoneale mesoteliale celler blev dyrket i microdevice i 16 timer og observeret under et lys-felt mikroskop. Som vist i figur 2A, blev kanalen bunden held dækket med et monolag af HPMC'er. Det er vigtigt at bemærke, at bobledannelse under fibronectin eller HPMC mønsterdannelse vil føre til …

Discussion

Dette assay giver en fleksibel og fysiologisk relevant model, der kan inkorporeres med forskellige biokemiske og cellebaserede assays, herunder, men ikke begrænset til, adhæsionsassays, mesothelial clearance assays og lægemiddelscreening. Det kan anvendes til evalueringen af ​​virkningen af ​​intraperitoneal mikromiljø på cancer progression. Men måske har brug for flere eksperimentelle betingelser, der skal optimeres, afhængigt af formålet med projektet (f.eks antallet af HPMC'er og kræft s…

Materials

Silicon wafer	University wafer	#1196	100mm
SU-8 2075 photoresist	Microchem
SU-8 developer	Microchem	108-65-6
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma	448931
Sylgard 184	Dow Corning	1673921	Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit
Biopsy punch	Miltex	33-31AA	1 mm diameter
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
Polyethylene tubing	SCI	BB31695-PE/5	0.86mm (inner diameter)
Syringe	Terumo
Syringe pump	Longer precision pump	LSP01-2A
Medium 199	Invitrogen	31100-035	Add 2.2g/L sodium bicarbonate
MCDB 105 Medium	Sigma	M6395
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30068.02
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15070-063
Trypsin EDTA solution	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin -0.01% EDTA, phenol red
Fibronectin human	BD	354008
Agarose	Invitrogen	15510-027
5-chloromethylfluorescein diacetate	Life technologies	C7025	Green CMFDA
CO2 incubator	SANYO	MCO-18AIC
Centrifuge	Hitachi	CT15RE
Fluorescent microscope	Nikon		Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT
SKOV-3			Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia)