Modelización del comportamiento del cáncer de ovario en un esferoide multicelular Microdevice 3D dinámico peritoneal
Summary
Para estudiar la progresión del tumor de ovario en un modelo fisiológicamente relevante, esferoides multicelulares se cultivaron en un microdispositivo bajo un flujo de fluido simulado. Este modelo 3D dinámico emula el medio ambiente intraperitoneal con los componentes celulares y mecánicas donde se produce la metástasis del cáncer de ovario.
Abstract
El cáncer de ovario se caracteriza por una amplia metástasis peritoneal, con esferas de tumores que se encuentran comúnmente en las ascitis maligna. Esto se asocia con pobres resultados clínicos y actualmente carece de tratamiento eficaz. Tanto los tres dimensiones (3D) medio ambiente y las fuerzas mecánicas dinámicas son factores muy importantes en esta cascada metastásica. Sin embargo, los cultivos celulares tradicionales no pueden recapitular este microambiente tumoral natural. Por lo tanto, en modelos in vivo -como que puede emular el entorno intraperitoneal son de importancia obvia. En este estudio, una nueva plataforma de microfluidos del peritoneo se creó para imitar la situación de los esferoides de cáncer de ovario en la cavidad peritoneal durante la metástasis. esferoides cáncer de ovario generados bajo una condición de no adherentes se cultivaron en canales microfluídicos recubiertas con células mesoteliales peritoneales sometidos a esfuerzo de cizalla fisiológicamente relevante. En resumen, esta dinámica 3D de micro-cáncer de ovario mesoteliorofluidic plataforma puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la biología básica del cáncer y servir como plataforma para la detección de drogas y el desarrollo potencial.
Introduction
El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal y se caracteriza por la diseminación peritoneal generalizada y la formación de ascitis maligna 1. Esta extensa metástasis peritoneal representa un reto clínico y se asocia con pobres resultados clínicos. A diferencia de la mayoría de los carcinomas sólidos que metastatizan a través de la sangre, cáncer de ovario difunde principalmente dentro de la cavidad peritoneal. Las células tumorales existen como agregados multicelulares / esferoides durante el proceso de metástasis 2. El hecho de que el cultivo en suspensión puede enriquecer las células madre de cáncer de ovario / iniciadoras del tumor sugiere además que estos esferoides pueden estar asociados tanto con la agresividad del tumor y mejorar la quimiorresistencia 3, 4. Existen diferencias en la respuesta a los fármacos entre las culturas en 2D y 3D, que presumiblemente tienen diferentes mecanismos moleculares 5.
_content "> La interacción esencial con el mesotelio construye el microambiente principal de la progresión del tumor de ovario. Estas células mesoteliales se encuentran en una matriz extracelular (ECM), donde la fibronectina es un constituyente ubicua. Un enlace entre el aumento de la expresión de la fibronectina derivado de células mesoteliales y la progresión del tumor se ha demostrado. la fibronectina es abundantemente presente en la ascitis maligna 6, 7. células de cáncer de ovario también son capaces de inducir la secreción de la fibronectina a partir de células mesoteliales a fin de promover principios de la metástasis del cáncer de ovario 8.Nuevas pruebas demuestran que los estímulos mecánicos, como el estrés de cizallamiento, pueden modular la morfología celular, la expresión génica, y, por lo tanto, los fenotipos de las células tumorales 9, 10, 11. Como ascitis maligna desarrollar y acumular durante tumor progresión, las células tumorales de ovario están expuestos al flujo de fluido y el esfuerzo cortante resultante. Un número de grupos, incluido el nuestro, han mostrado el efecto de la tensión de cizallamiento en la progresión del cáncer de ovario, incluyendo las modificaciones del citoesqueleto, transiciones epitelio-mesenquimal, y stemness cáncer 12, 13, 14, 15. Por lo tanto, un microambiente fisiológicamente relevante es importante para la investigación de la metástasis peritoneal tumor. Sin embargo, los sistemas de cultivo in vitro hidrodinámicas actuales tienen limitaciones en la imitación y el control de una constante,, el estrés bajo fisiológicamente relevante de cizallamiento 16, 17, 18, 19. Convencional in vitro acerca de enfoque ya sea en el entorno celular o mecánica todavía están limitados enimitando la complejidad del microambiente intraperitoneal con relevancia fisiológica adecuada.
Aquí, con el fin de diseñar un nuevo modelo del peritoneo para superar las limitaciones de las estrategias convencionales y para avanzar en el estudio del compartimiento intraperitoneal en la metástasis del cáncer, una plataforma basada en microfluidos 3D con el flujo de fluido controlado fue diseñado. En este modelo, esferoides de cáncer de ovario fueron co-cultivadas con células peritoneales humanas primarias mesoteliales en chips microfluídicos bajo flujo de fluido continuo (Figura 1A). Las células mesoteliales se sembraron en fibronectina. No adherentes esferoides de cáncer de ovario se sembraron en canales de microfluidos con medio de flujo continuo perfundido por una bomba de jeringa. Tanto el entorno 3D y las fuerzas mecánicas dinámicas son factores muy importantes de la cascada metastásica. Esta plataforma puede ser utilizado para investigar el microambiente intraperitoneal en términos de cel complejolular y co-cultivo de las interacciones, así como con respecto a las señales mecánicas dinámicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este ensayo ofrece un modelo flexible y fisiológicamente relevante que se puede incorporar con diversos ensayos bioquímicos y basados en células, incluyendo, pero no limitado a, los ensayos de adhesión, ensayos de remoción mesoteliales, y la detección de drogas. Se puede aplicar a la evaluación del efecto del microambiente intraperitoneal en la progresión del cáncer. Sin embargo, podría ser necesario optimizar varias condiciones experimentales, dependiendo de los objetivos del proyecto (por ejemplo,<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por Hong Kong Consejo de Ayuda de Investigación (17.122.014 subvenciones, C1013-15G, 719813E, y 17304514). AST Wong es un receptor de la Croucher superiores de becas de investigación.
Materials
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin -0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
Riferimenti
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
- Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
- Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
- Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
- Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
- Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
- Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
- Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).
