Modellering äggstockscancer flercelliga Sfäroid Beteende i en dynamisk 3D Peritoneal mikroanordning

Summary

För att studera äggstockstumörprogression i en fysiologiskt relevant modell, flercelliga spheroids odlades i en mikroanordning under simulerad vätskeflöde. Denna dynamiska 3D-modell emulerar intraperitoneal miljö med de cellulära och mekaniska komponenter där äggstockscancer metastas inträffar.

Abstract

Äggstockscancer kännetecknas av omfattande peritoneal metastas, med tumörsfärer vanligen återfinns i de maligna ascites. Detta är förenat med dålig kliniska resultat och för närvarande saknar effektiv behandling. Både den tredimensionella (3D) miljö och dynamiska mekaniska krafter är mycket viktiga faktorer i detta metastaserande kaskad. Emellertid traditionella cellkulturer misslyckas med att rekapitulera denna naturliga tumörmikromiljön. Således, in vivo-liknande modeller som kan emulera intraperitoneal miljö är av uppenbar betydelse. I denna studie har en ny mikroflödes plattform bukhinnan inrättats för att efterlikna situationen för äggstockscancer sfäroider i bukhålan under metastas. Äggstockscancer sfäroider som erhållits under en icke-vidhäftande tillstånd odlades i mikroflödessystem kanaler belagda med peritoneala mesotelceller utsattes för fysiologiskt relevant skjuvspänning. Sammanfattningsvis, denna dynamiska 3D äggstockscancer-mesothelium microfluidic plattform kan ge ny kunskap om grundläggande cancerbiologi och fungera som en plattform för potentiell läkemedelsscreening och utveckling.

Introduction

Äggstockscancer är den mest dödliga gynekologisk cancer och kännetecknas av omfattande peritoneal spridning och bildandet av malign ascites ^en. Denna omfattande peritoneal metastas utgör en stor klinisk utmaning och är associerad med dåliga kliniska resultat. Skillnad från de flesta solida karcinom som metastaserar via blodet, äggstockscancer sprider främst inom den peritoneala håligheten. Tumörceller existerar som flercelliga aggregat / spheroids under processen av metastaser ^2. Det faktum att suspensionskultur kan berika äggstockscancer stamceller / tumör-initierande celler antyder vidare att dessa sfäroider kan vara associerad med både tumör aggressivitet och förbättrad chemoresistance ^{3, 4.} Det finns skillnader i läkemedelssvar mellan 2D- och 3D-kulturer, som förmodligen har olika molekylära mekanismer ^5.

_content "> Den väsentliga interaktion med mesothelium konstruerar primära mikro för äggstockstumörprogression. Dessa mesotelceller ligga på en extracellulär matris (ECM), där fibronektin är en allestädes närvarande beståndsdel. En länk mellan det ökade uttrycket av mesotelceller härrörande fibronektin och tumörprogression har visats. fibronektin är högst närvarande i malign ascites ^{6, 7.} ovarian cancerceller har även möjlighet att inducera utsöndring av fibronektin från mesotelceller i syfte att främja tidig äggstockscancer metastas ^8.

Emerging bevis visar att mekaniska stimuli, inklusive skjuvspänning, kan modulera cellmorfologin, genexpression, och således de fenotyper av tumörceller ^{9, 10, 11.} Som malign ascites utveckla och ackumuleras under tumor progression, är äggstockstumörceller exponerade för fluidflöde och den resulterande skjuvspänningen. Ett antal grupper, vårt ingår, har visat effekterna av skjuvspänning på äggstockscancer progression, inklusive cytoskelettsystemen modifieringar, epitelial-to-mesenkymala övergångar och cancer stemness ^{12, 13, 14, 15.} Således är det viktigt för undersökning av tumör peritoneal metastas en fysiologiskt relevant mikromiljö. De nuvarande in vitro hydrodynamiska odlingssystem har begränsningar på härma och styrning av en konstant, låg, fysiologiskt relevant skjuvspänning ^{16, 17, 18, 19.} Konventionell in vitro metoder med fokus på antingen cellulära eller mekanisk miljö är fortfarande begränsade iimitera komplexitet intraperitoneal mikro med rätt fysiologisk relevans.

Här, i syfte att konstruera en ny modell av bukhinnan att övervinna begränsningarna hos konventionella strategier och att främja studiet av intraperitoneal fack i cancermetastaser, var en 3D mikroflödes-baserad plattform med kontrollerad vätskeflöde utformade. I denna modell, äggstockscancer sfäroider samodlades med primära humana peritoneala mesotelceller i mikroflödessystem marker under kontinuerlig fluidflöde (Figur 1A). Mesotelcellerna plattades på fibronektin. Icke-vidhäftande äggstockscancer sfäroider såddes i mikroflödessystem kanaler med kontinuerligt flöde mediet perfusion av en sprutpump. Både 3D-miljön och de dynamiska mekaniska krafterna är mycket viktiga faktorer i den metastatiska kaskaden. Denna plattform kan användas för att undersöka den intraperitoneala mikromiljön i termer av komplexa cellular och co-culture interaktioner, liksom med avseende på dynamiska mekaniska signaler.

Protocol

1. mikroflödessystem enhet Design och Fabrication Mikroflödeshuvudmallen Design och dra mikroflödeskanalmönstret med någon datorstödd konstruktion (CAD) programvara. OBS! Normalt CAD-ritningen kan skickas till en fotomask företaget att producera fotomasken. Den mikroflödes Konstruktionen består av tre identiska parallella kanaler, var och en med följande dimensioner: 4 mm x 25 mm x 250 ^ m (bredd x längd x höjd) och ställa in två mm från varandra. Båda kanal ändar utformade me…

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll var en mikroflödes plattform inrättas för att modellera äggstockscancer sfäroider med mesotelceller enligt hydrodynamiska förhållanden. Primära humana peritoneala mesotelceller odlades i mikroanordning under 16 h och observerades under ett ljusfältsmikroskop. Såsom visas i fig 2A, var kanalbotten framgångsrikt täckt med ett monoskikt av HPMC. Det är viktigt att notera att bubbelbildning under fibronektin eller HPMC mönstring ko…

Discussion

Denna analys ger en flexibel och fysiologiskt relevant modell som kan införlivas med olika biokemiska och cellbaserade analyser, inklusive, men inte begränsat till, vidhäftningsanalyser, mesothelial clearance-analyser och läkemedelsscreening. Det kan appliceras på utvärdering av effekten av den intraperitoneala mikro på cancerutveckling. Däremot kan flera experimentella betingelser måste optimeras, beroende på syftet med projektet (t.ex. antalet HPMC och cancer sfäroider sådda per kanal, co-odlingst…

Materials

Silicon wafer	University wafer	#1196	100mm
SU-8 2075 photoresist	Microchem
SU-8 developer	Microchem	108-65-6
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma	448931
Sylgard 184	Dow Corning	1673921	Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit
Biopsy punch	Miltex	33-31AA	1 mm diameter
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
Polyethylene tubing	SCI	BB31695-PE/5	0.86mm (inner diameter)
Syringe	Terumo
Syringe pump	Longer precision pump	LSP01-2A
Medium 199	Invitrogen	31100-035	Add 2.2g/L sodium bicarbonate
MCDB 105 Medium	Sigma	M6395
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30068.02
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15070-063
Trypsin EDTA solution	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin -0.01% EDTA, phenol red
Fibronectin human	BD	354008
Agarose	Invitrogen	15510-027
5-chloromethylfluorescein diacetate	Life technologies	C7025	Green CMFDA
CO2 incubator	SANYO	MCO-18AIC
Centrifuge	Hitachi	CT15RE
Fluorescent microscope	Nikon		Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT
SKOV-3			Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia)