Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso
Summary
Qui, descriviamo un completo flusso di lavoro per l’analisi qualitativa e quantitativa del sistema immunitarie sinapsi tra cellule T umane primarie e cellule presentanti l’antigene. Il metodo si basa su imaging citometria a flusso, che permette l’acquisizione e la valutazione di diverse immagini di migliaia di cellule all’interno di un periodo di tempo relativamente breve.
Abstract
La sinapsi immune è l’area di comunicazione tra le cellule di T e cellule presentanti l’antigene (APCs). Cellule T polarizzano recettori e proteine verso la sinapsi immune per assicurare un’associazione stabile e cambio di segnale. Microscopia confocale, TIRF o super-risoluzione classica sono stati usati per studiare la sinapsi immune. Poiché questi metodi richiedono acquisizione immagine manuale e quantificazione richiede molto tempo, l’imaging di eventi rari è impegnativo. Qui, descriviamo un flusso di lavoro che consente l’analisi morfologica di decine di migliaia di celle. Sinapsi immuni sono indotte tra cellule T umane primarie nelle preparazioni di pan-leucociti e cellule di Raji B SEB-caricato di Staphylococcus aureus enterotossina come APC. Acquisizione delle immagini viene eseguita con imaging citometria a flusso, anche chiamato microscopia In-Flow, che combina le caratteristiche di un citometro a flusso e un microscopio a fluorescenza. Una completa strategia di gating per l’identificazione delle cellule T/APC coppie e analizzando le sinapsi immuni è fornita. Come questo flusso di lavoro consente l’analisi di immunitario sinapsi in preparazioni non purificata pan-del leucocita e quindi richiede solo un piccolo volume di sangue (cioè, 1 mL), può essere applicato a campioni da pazienti. D’importanza, diversi campioni possono essere preparati, misurati e analizzati in parallelo.
Introduction
Le cellule T sono importanti regolatori del sistema immunitario adattativo e vengono attivate attraverso peptidi antigenici che sono presentati nel contesto dei complessi di istocompatibilità (MHC). Attivazione a cellula T completo richiede due segnali, il segnale di competenza attraverso il recettore di antigene-specifiche cellule T (TCR) / CD3 complesso e il segnale di costimolazione tramite ricevitori accessori. Entrambi i segnali sono generati attraverso l’interazione diretta delle cellule di T con presentanti l’antigene (APCs) di cellule. APCs maturo forniscono il segnale di competenza per l’attivazione di cellule T attraverso complessi MHC-peptide, ed esprimono ligandi costimolazione (ad es., CD80 o CD86) per assicurare la progressione della cellula T di attivazione1. Una importante funzione di costimolazione è il riarrangiamento del citoscheletro actina2,3,4. La F-actina corticale è relativamente statico in cellule di T di riposo. Stimolazione delle cellule T attraverso antigene-cuscinetto APCs conduce ad una profonda riorganizzazione del citoscheletro. Dinamica dell’actina (cioè, veloce actina polimerizzazione/depolimerizzazione cerchi) attiva le cellule di T di creare forze che vengono utilizzate per il trasporto di proteine o organelli, ad esempio. Inoltre, il citoscheletro di actina è importante per lo sviluppo di una speciale zona di contatto tra le cellule di T e APC, chiamato sinapsi immune. Data l’importanza del citoscheletro alla sinapsi immune, è diventato essenziale per sviluppare metodi per quantificare i cambiamenti nel citoscheletro delle cellule T5,6,7,8 , 9.
Per mezzo di aiuti del citoscheletro di actina, recettori e proteine di segnalazione sono segregati nei cluster di attivazione supramolecolari (SMACs) all’interno della sinapsi immune. La stabilità della sinapsi immune è assicurata dall’associazione dei recettori ai pacchi di F-actina che aumentano l’elasticità del citoscheletro. Formazione della sinapsi immuni è stato indicato per essere critico per la generazione della risposta immune adattativa. Gli effetti nocivi di una formazione di sinapsi immunitaria difettosa in vivo in primo luogo sono stati realizzati in pazienti affetti da Wiskott Aldrich sindrome (WAS), una malattia in cui polimerizzazione dell’actina e, simultaneamente, la formazione della sinapsi immuni sono disturbati10 . ERA i pazienti possono soffrire di eczema, gravi infezioni ricorrenti, malattie autoimmuni e melanomi. Nonostante questa individuazione, attualmente non è noto se la formazione della sinapsi immuni è diverso nelle cellule T di individui sani e pazienti affetti da malattie autoimmuni o difetti immuni.
Microscopia a fluorescenza, compresi confocale, TIRF e microscopia di Super-risoluzione, sono stati utilizzati per scoprire l’architettura del sistema immunitario sinapsi11,12,13,14. L’alta risoluzione di questi sistemi e la possibilità di effettuare formazione immagine della vivere-cella consente la raccolta di informazioni esatte, spazio-temporali su citoscheletro e proteine di superficie o intracellulare nella sinapsi immune. Molti risultati, tuttavia, sono basati sull’analisi di solo poche decine di cellule T. Inoltre, le cellule T devono essere depurate per questi tipi di microscopia a fluorescenza. Tuttavia, per molte domande di ricerca, l’uso di cellule impura, piuttosto che la risoluzione massima possibile è della massima importanza. Ciò è rilevante se le cellule di T dai pazienti vengono analizzate, dato che l’importo delle donazioni di sangue è limitato e potrebbe esserci la necessità di elaborare molti campioni in parallelo.
Abbiamo stabilito metodi microscopici che consentono l’analisi del citoscheletro nella sinapsi immune nel sistema umano15,16,17. Questi metodi sono basati su citometria a flusso, anche denominato In-Flow microscopia18di imaging. Come un ibrido tra microscopia di fluorescenza e citometria a flusso multispettrale, citometria a flusso di imaging ha suoi punti di forza nell’analizzare parametri morfologici e la localizzazione della proteina in popolazioni eterogenee delle cellule, quali pan-leucociti dalla nel sangue periferico. Abbiamo introdotto una metodologia che permette di quantificare F-actina in coniugati di T-cellula/APC di cellule T umane da campioni di sangue intero, senza la necessità di lunghe e costose purificazione passaggi17. La tecnica qui presentata comprende l’intero flusso di lavoro, di ottenere il campione di sangue per la quantificazione di F-actina nella sinapsi immune.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il flusso di lavoro qui presentato consente la quantificazione di immuni sinapsi tra cellule T umane (ex vivo) e APC. In particolare, dell’eritrocito-lisate pan-leucociti sono stati utilizzati come fonti di cellule T, rendendo superfluo fasi di purificazione della T-cellula. La linea cellulare di linfoma della B-cellula Raji servita come surrogato APCs. Questo comporta notevoli vantaggi, poiché permette confronti tra i donatori di sangue del lato della T-cellula della sinapsi immune. Inoltre, DCs autologo sono difficilm…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato finanziato dal Consiglio di ricerca tedesco (DFG) con sovvenzioni No. SFB-938-M e SA 393/3-4.
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
Riferimenti
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O’Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
