Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz
Summary
Burada, biz birincil insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarda nitel ve nicel analizi için tam bir iş akışı tanımlamak. Yöntem alma ve nispeten kısa bir süre içinde birkaç bin hücre görüntülerin değerlendirme sağlar görüntüleme akış sitometresi temel alır.
Abstract
Bağışıklık synapse T hücreleri ve antijen sunan hücreler (ZPT) arasındaki iletişimi alanıdır. T hücre yüzey reseptörlerinin ve proteinler istikrarlı bir bağlama temin ve Satım sinyal için bağışıklık synapse doğru kutuplaştırmaya. Klasik confocal, TIRF veya Süper çözünürlük mikroskobu bağışıklık synapse eğitim için kullanılmıştır. El ile resim alma ve zaman alıcı miktar bu yöntemler gerektiren bu yana, nadir olayları görüntüleme meydan okuyor. Burada, on binlerce hücre morfolojik analiz sağlayan bir iş akışı açıklanmaktadır. Bağışıklık sinapslarda pan-lökosit müstahzarları birincil insan T hücreleri ve Staphylococcus aureus enterotoxin B SEB-yüklü Raji hücreleri arasında ZPT indüklenen vardır. Resim alma akış sitometresi özelliklerini barındıran bir akış sitometresi ve floresan mikroskop akış denetimli mikroskobu olarak da bilinir, Imaging ile gerçekleştirilir. T hücre/APC çiftler belirlenmesi ve bağışıklık sinapslarda analiz tam bir perdeleme strateji sağlanır. Bu iş akışı bağışıklık Analizi synapses unpurified pan-lökosit hazırlıkları ve dolayısıyla kan sadece küçük bir birim gerektiriyor verdiğinden (yani, 1 mL), Bu hastalardan örnekleri için uygulanabilir. Önemlisi, çeşitli örnekleri hazır, ölçülebilir ve buna paralel olarak analiz.
Introduction
T hücreleri edinilmiş bağışıklık sisteminin ana düzenleyiciler edilir ve MHC kompleksi (MHC) kapsamında sunulan antijenik peptidler aracılığıyla etkinleştirilir. Tam T Hücre aktivasyonu gerektirir iki sinyal, antijen spesifik T-hücre reseptör (TCR) üzerinden yetkinlik sinyal / CD3 kompleksi ve costimulatory sinyal aksesuar reseptörleri üzerinden. Her iki sinyali antijen sunma ile T hücrelerinin etkileşimi doğrudan aracılığıyla oluşturulan hücreler (ZPT). Olgun ZPT yetkinlik sinyal MHC-peptid kompleksi ile T Hücre aktivasyonu için sağlamak ve costimulatory ligandlar express (örneğin, CD80 veya CD86) T-hücre harekete geçirmek1ilerlemesini sağlamak için. Bir önemli costimulation düzenlenmesi aktin sitoiskeleti2,3,4fonksiyonudur. Kortikal F-aktin T hücreleri dinlenme nispeten statiktir. T-hücre stimülasyon aracılığıyla antijen-ZPT taşıyan aktin sitoiskeleti derin bir düzenlenmesi için yol açar. Aktin dynamics (yani, hızlı aktin polimerizasyon/bozulumu daireler) proteinler veya organelleri, örneğin taşıma için kullanılan kuvvetler oluşturmak T hücreleri etkinleştirin. Ayrıca, aktin sitoiskeleti T hücreleri ve bağışıklık sinaps denilen ZPT, arasında özel bir iletişim bölge geliştirmek için önemlidir. Aktin sitoiskeleti bağışıklık synapse için önemi nedeniyle, bu aktin sitoiskeleti T hücreleri5,6,7,8 değişiklikleri ölçmek için yöntemler geliştirmek için gerekli hale geldi , 9.
Aktin hücre iskeleti yardım sayesinde, bağışıklık synapse içinde (SMACs) supramolecular harekete geçirmek kümelerdeki yüzey reseptörlerinin ve sinyal proteinleri ayrılmış. Bağışıklık synapse kararlılığını reseptörleri aktin sitoiskeleti esnekliğini artırmak F-aktin paketler için bağlama tarafından güvence altına alınmıştır. Edinilmiş bağışıklık yanıtı oluşturmak için kritik olmak bağışıklık synapse oluşumu gösterilmiştir. Arızalı bağışıklık synapse oluşumu içinde vivo zararlı etkilerini ilk Wiskott Aldrich sendromu (WAS), hangi aktin polimerizasyon hastalığında gelen acı hastalarda fark ve kullanılazlar, bağışıklık synapse oluşumu rahatsız10 . Hastalar egzama, şiddetli tekrarlayan enfeksiyonlar, otoimmün hastalıklar ve melanomlar muzdarip yapıldı. Bu bulgu rağmen Şu anda sağlıklı bireyler ve hastaların acı bağışıklık kusurları veya otoimmün hastalıklar T hücrelerinde farklı bağışıklık synapse oluşumu bilinmemektedir.
Floresans mikroskobu, confocal de dahil olmak üzere, TIRF ve süper çözünürlük mikroskobu, bağışıklık synapse11,12,13,14mimarisini ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Bu sistemlerin yüksek çözünürlüklü ve canlı hücre görüntüleme gerçekleştirme imkanı aktin sitoiskeleti ve bağışıklık synapse yüzey veya hücre içi proteinlerin hakkında tam ve kendisinin zamansal bilgi toplama sağlar. Fazla sonuç, ancak, yalnızca birkaç on T hücrelerinin analizine dayanır. Ayrıca, T hücreleri floresan mikroskopi bu tür için saf olmalı. Ancak, birçok araştırma soruları için mümkün en yüksek çözünürlük yerine unpurified hücreleri kullanımı son derece önemlidir. Bu hastalarda T hücreleri, bağışlanan kan miktarı sınırlıdır ve paralel olarak pek çok örnekleri işlemek için gereken olabilir analiz edilir uygundur.
İnsan sistemi15,16,17bağışıklık synapse aktin sitoiskeleti analizine izin mikroskobik yöntemleri kurduk. Bu yöntemler akış sitometresi akış denetimli mikroskobu18olarak da bilinir, Imaging üzerinde temel alır. Spektral akış sitometresi ve floresan mikroskopi arasında bir melez akış sitometresi Imaging’in morfolojik parametreleri ve pan-lökosit gibi türdeş olmayan hücre popülasyonlarının protein yerelleşme analiz onun güçlü vardır periferik kan. T-hücre/APC conjugates tam kan örneklerinden, zaman alıcı ve pahalı arıtma adımları17, gerek kalmadan insan T hücrelerinin içinde F-aktin ölçmek sağlar bir metodoloji tanıttı. Burada sunulan teknik F-aktin miktar olarak bağışıklık synapse için kan örneği almak tüm iş akışı, oluşmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan iş akışı insan T hücreleri (ex vivo) ve ZPT arasında bağışıklık sinapslarda miktar sağlar. Özellikle, eritrosit lysed pan-lökosit T hücreli arıtma adımları gereksiz yapma T-hücre kaynağı olarak kullanıldı. B hücreli lenfoma hücre kültürünü Raji ZPT vekil olarak görev yaptı. Kan bağış bağışıklık synapse T hücreli tarafı arasında karşılaştırma yapmayı sağlar beri bu önemli avantajları, ayılar. Ayrıca, otolog DCs doğrudan periferik kan grubundan pek mevcutt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
İşi Alman Araştırma Konseyi (DFG) tarafından hibe ile No finanse edildi SFB-938-M ve SA 393/3-4.
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
Riferimenti
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O’Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
