De<em> Ex vivo</em> Colon orgel kultur och dess användning i Antimicrobial värdförsvaret Studies
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
Tarmen visar en arkitektur av repetitiva crypt strukturer som består av olika typer av epitelceller, lamina propria innehållande immunceller, och stroma. Alla dessa heterogena celler bidrar till tarm homeostas och delta i antimikrobiella värdförsvaret. Därför identifiera en ersättningsmodellen för att studera immunsvaret och antimikrobiell aktivitet av tarmen i en in vitro miljö är extremt utmanande. In vitro-studier med hjälp av odödliggjorda tarm epitel cellinjer eller ens primära kryptan organoida kultur inte representerar den exakta fysiologi normal tarmen och dess mikromiljö. Här, diskuterar vi en metod för odling mus kolonvävnad i en odlingsskål och hur detta ex vivo organkultursystem kan implementeras i studier relaterade till antimikrobiella värdförsvarssvar. I representativa experiment visade vi att kolon i organkultur uttrycka antimikrobiella peptider i response på exogent IL-1β och IL-18. Vidare, de antimikrobiella effektormolekyler som produceras av kolon vävnader i organodling döda effektivt Escherichia coli in vitro. Detta tillvägagångssätt kan därför användas för att dissekera den roll som pathogen- och varnings-associerade molekylära mönster och deras cellulära receptorer i regleringen av intestinal medfödda immunresponser och antimikrobiella värdförsvarssvar.
Introduction
Tarmen representerar ett dynamiskt system som verkar som en barriär för kommensala mikroorganismer, kämpar mot invaderande patogener, och reglerar den mikrobiella kompositionen en. De intestinala epitelceller, som består av enterocyter, bägarceller, panethceller och enteroendocrine celler, är de stora cellpopulationer som ger värdförsvarssvar mot tarmfloran. Gobletceller producerar muciner som skapar en demilitariserad zon på toppen av epitelskiktet 2. De panethceller och enterocyter producera antimikrobiella peptider, cytokiner och reaktiva syre- och kväve arter som utgör antimikrobiella värdförsvars svaren och bidrar till att forma tarmmikrobiella sammansättningen 3, 4. I tillägg till epitelceller, immunceller inkluderande makrofager, dendritiska celler, neutrofiler, naturliga mördarceller, lymfocyter och inna te lymfoidceller i lamina propria och submucosa spela en avgörande roll i tarmantimikrobiella värdförsvars svar genom att producera cytokiner, kemokiner och andra mediatorer 5 – 7. För att förstå hur det mukosala immunsystemet reglerar mikrobiota och ger skydd mot mikrobiell infektion, är det viktigt att beakta det komplexa samspelet mellan de heterogena cellpopulationer i tarmen. Emellertid är inte tillgängligt en in vitro-modell som omfattar alla de funktioner i tarmen. Därför molekylära studier på värdpatogen interaktion i tarmen är mycket utmanande.
Under de senaste åren har flera modellsystem som efterliknar delar av tarmslemhinnan har utvecklats för att undersöka patofysiologiska processer involverade i inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD) och andra gastrointestinala störningar 8 –= "xref"> 14. Odödliggjorda intestinala epiteliala cellinjer används ofta för att studera epitelceller specifika svar. Men på grund av differentiell genexpression och funktion i immortaliserade celler, de data som erhålls från användningen av dessa celler inte ofta matcha med de som observerats i in vivo-studier. Intestinal crypt organoida kultur har nyligen dykt upp som ett potentiellt verktyg för att utvärdera effekten av tarmepitelet till olika stimuli 13. I detta system är crypt stamceller tillåts växa och utveckla en 3D organoid struktur. Medan den organoid odlingssystemet är mycket användbart för att studera många aspekter av tarmepitelet, betyder inte härma den komplexa interaktionen av immunceller, epitelceller och mikrobiella produkter. Ex vivo kultur av tarmvävnaden erbjuder en bättre representation av in vivo-värdförsvarssvar. I denna metod odlas i en cellkulturplatta vett en del av tarmenh lämpliga medier gör det möjligt för olika typer av cellpopulationer i tarmen vara metaboliskt aktiva under åtminstone 48 timmar. Sålunda kan användas en ex vivo odling av organet för att mäta uttrycket av antimikrobiella gener och värdförsvars responser i tarmen till en särskild stimulus.
Undersökare har använt ex vivo organkultursystem för att studera värdförsvarssvar mot mikrobiell infektion i tarmen 15-21. Vi antog nyligen organkultursystem för att studera rollen av inflammasome i antimikrobiella värdförsvars svar i mus kolon 22. Den inflammasome är en molekylär plattform för aktivering av kaspas-1, som krävs för produktion av mognat IL-1β och IL-18. Vi visade att IL-1β och IL-18 inducerar antimikrobiella peptider som effektivt dödar commensal pathobionts såsom E. coli </em>. Denna observation överensstämde med ökad E. coli börda i inflammasome defekta mus kolon 22. Detta system kan därför användas för att studera rollen av mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS) och andra medfödda immunmolekyler i intestinala antimikrobiella värdförsvarssvar samt patogenes av tarmstörningar såsom inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och kolorektal cancer (CRC). Det finns mer än 200 IBD känslighetsgener, och mutationer i många av dessa gener är associerade med förändrad mikrobiella kompositionen i tarmen. Det är av stor klinisk betydelse för att bestämma den exakta mekanismen genom vilken IBD-resistensgener reglerar tarmfloran. Det övergripande målet med denna metod är att införa en grundläggande protokoll för ex vivo kolon organkultur och visa hur denna kultur metod kan användas för att studera antimikrobiella värdförsvars svar i tarmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tarmepitelceller är mycket känsliga när det gäller deras tillväxtkrav och därför svår att kulturen. Epitelcellerna isolerats av EDTA-behandling överlever inte i konventionella cellodlingsmedia såsom DMEM 8. Därför värd-patogen interaktionsstudier med hjälp av isolerade crypt eller primära epitelceller är mycket utmanande. Nyligen Sato et al. beskrev en krypta organoid kultursystem som är mycket lovande och användbar för studier relaterade till tarm patofysiologi <sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av medel från Crohns och kolit Foundation of America (CCFA, 3711) Cancer Prevention och Forskningsinstitut Texas (CPRIT, RP160169), och UT Southwestern Medical Center ges till MHZ
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
References
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).
- Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota. Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).
- Wu, H. J., Wu, E. The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity. Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).
- Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).
- Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. Innate immunity in disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).
- Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. Intestinal epithelial cells in vitro. Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).
- Autrup, H. Explant culture of human colon. Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).
- Qin, J., et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 464, 59-65 (2010).
- Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut. 61, 961-962 (2012).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. 63, 1345-1354 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61, 1007-1015 (2012).
- Haque, A., et al. Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants. Gut. 53, 1424-1430 (2004).
- Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro. Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).
- Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies. Infect Immun. 44, 514-518 (1984).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J Anat. 134, 459-469 (1982).
- Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli. Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).
- Bareiss, P. M., et al. Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa. Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).
- Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants. J Vis Exp. , e4368 (2013).
- Hu, S., et al. The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense. Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).
- Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium. J Pathol. 180, 102-105 (1996).
- Dame, M. K., et al. Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).
- Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni. FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).
