إعادة تشكيل جسيم نووي مع الهستونات الأخت المسمى النظائر-تفاضلي
Summary
يصف هذا البروتوكول إعادة تشكيل جسيم نووي يحتوي على تفاضلي الهستونات شقيقة المسمى النظير. وفي الوقت نفسه، جسيم نووي تعديل غير متماثلة بعد translationally يمكن أن تتولد بعد استخدام نسخة هيستون premodified. هذه الاستعدادات يمكن استخدامها بسهولة لدراسة آليات التعديل المتبادل، في وقت واحد في كل من الهستونات الشقيقة، وذلك باستخدام عالية الدقة الرنين المغناطيسي الطيفي.
Abstract
جسيم نووي تعديل غير متماثلة يحتوي على نسختين من هيستون (الهستونات شقيقة) مزينة مجموعات متميزة من التعديلات بعد متعدية (PTMs). يتم التعرف عليهم حديثا أنواع وسائل غير معروفة من إنشاء والآثار الوظيفية. الأساليب التحليلية الحالية غير كافية للكشف عن حدوث-نسخة محددة من PTMs على الهستونات شقيقة nucleosomal. ويعرض هذا البروتوكول طريقة الكيمياء الحيوية لإعادة في المختبر من جسيم نووي يحتوي على تفاضلي الهستونات شقيقة المسمى النظير. مجمع الناتجة يمكن أن يكون أيضا تعديل غير متماثلة، بعد بما في ذلك حمام هيستون premodified خلال refolding من subcomplexes هيستون. ويمكن لهذه الاستعدادات جسيم نووي غير المتماثلة يكون بسهولة كان رد فعل مع إنزيمات تعديل هيستون لدراسة الآليات عبر الحديث التعديل الذي فرضته PTM غير متماثلة قبل إدراجها باستخدام التحليل الطيفي النووي بالرنين المغناطيسي (NMR). بشكل خاص، ردود فعل التعديل فيفي الوقت الحقيقي يمكن تعيين بشكل مستقل على اثنين من الهستونات الشقيقة عن طريق إجراء أنواع مختلفة من التجارب علاقة الرنين النووي المغناطيسي، مصممة خصيصا لنوع النظير منها. توفر هذه المنهجية وسيلة لدراسة آليات الحديث المتبادل التي تساهم في تشكيل وانتشار أنماط PTM غير المتماثلة على المجمعات nucleosomal.
Introduction
وتعبئتها الحمض النووي حقيقية النواة بإحكام داخل نواة الخلية إلى لونين. لبنة أساسية من لونين هو الجسيمات الأساسية جسيم نووي يحتوي على ~ 147 شركة بريتيش بتروليوم من الحمض النووي ملفوفة حول مجمع octameric تتكون من نسختين لكل من histones الأساسية الأربعة (H3، H4، H2A، H2B). البروتينات هيستون تؤوي مجموعة كبيرة من التعديلات بعد متعدية (PTMs). هذه التبديلات التساهمية تحفز تغييرات في هيكل الكروماتين، سواء بصورة مباشرة أو عن طريق التأثير على الكيمياء الفيزيائية للنظام وبشكل غير مباشر من خلال تجنيد أنشطة إعادة عرض لونين 1، 2، 3. من خلال هذه الوسائل، PTMs هيستون تسيطر الكروماتين الوصول، وبالتالي تنظيم جميع الوظائف الخلوية المعتمدة على الحمض النووي (4).
يتم تثبيت PTMs من قبل أنظمة انزيم تعديل هيستون أساسا على قطاعات N-الطرفية غير منظم (ذيول) من HISTO الأساسية أدرجت جسيم نوويالأخبار. بسبب العديد من مواقع تعديل على سلسلة قصيرة نسبيا من ذيول هيستون، PTMs التأثير على بعضهم البعض عن طريق حفز أو منع ردود الفعل تعديل لاحقة، وهو تأثير يعرف باسم تعديل عبر الحديث 5. بسبب بنية متماثلة العامة للجسيم نووي، ويعتقد أن ردود الفعل تعديل وآليات الحديث المتبادل أن يحدث بالمثل على نسختين من كل هيستون nucleosomal (الهستونات شقيقة). وقد تحدى هذا المفهوم مؤخرا ودحضت في وقت لاحق. بشكل خاص، أظهرت فحوصات في المختبر الأنزيمية على هيستون مجانا الببتيدات H3 الذيل وعلى جسيم نووي أن مجموعة من تحركات H3 قدم الفسفرة بطريقة غير المتماثلة 6. بالإضافة إلى ذلك، كشف التحليل LC-MS / MS أساس تقارب تنقية-وجود جسيم نووي غير متماثلة، ميثليته H3 في عدة أنواع من الخلايا حقيقية النواة 7. وهكذا، جسيم نووي تعديل غير متجانس تشكل الأنواع الجديدة، وهناك حاجة إلى أدوات للكشف عن الآليات التي تتحكم في تكوينها وتحليل الآثار الحديث المتبادل أن هذا التباين قد تمارس.
عادة، وقد استخدمت الغربية التنشيف (WB) والطيف الكتلي (MS) تحليل للكشف عن PTMs هيستون. وعلى الرغم من تطبيقه سهلا، WB يعاني من مشاكل في الخصوصية / عبر التفاعل. وعلاوة على ذلك، فإنه غير قادر على القيام بها احد تحليل متعدد PTM والمباشر لكمية ردود الفعل تعديل 8. من ناحية أخرى، تحليل MS يعمل الأجهزة المتطورة التي تتطلب تدريبا رفيع المستوى، ولكنها توفر خصوصية عالية، فضلا عن رسم الخرائط في وقت واحد وتقدير من PTMs متعددة 9. ومع ذلك، على حد سواء الأساليب التخريبية ونأت المجمعات nucleosomal قبل التحليل، مما أدى إلى خليط من الهستونات و / أو الببتيدات المستمدة هيستون. هذا التلاعب يزيل القدرة على التمييز مستقلةردود الفعل التعديل التي تحدث في كل من البلدين الشقيقين الهستونات وتقرير حالة تعديل نسخ معينة من الهستونات nucleosomal.
الرنين المغناطيسي (NMR) الطيفي النووي تطورت كطريقة بديلة لرسم خريطة ردود الفعل PTM. NMR غير nondisruptive وبالتالي يسمح للرصد الأحداث PTM بطريقة الوقت الحقيقي في خليط من تشكيلها، وحتى في خلايا سليمة 10 و 11. تطوير إجراءات للحصول على البيانات بسرعة وكذلك لرسم الخرائط عالية الدقة على أساس 2D طرق ارتباط-مغاير النووي من عينات المسمى النظير (15 N و / أو 13 C) 12 يسمح تعيين وقت واحد من أنواع مختلفة من PTMs، مثل كما سيرين / ثريونين / الفسفرة التيروزين، أستلة يسين / مثيلة، وأرجينين مثيلة 13. اعتمادا على PTM قيد التحقيق، 15 N- أو 13 C-وضع العلامات والعلاقات العامةيمكن استخدامها otocols للاحتفال مجموعة وظيفية البروتين الذي يعمل كمراسل تعديل. ونتيجة لذلك، ورسم الخرائط PTM لا يمكن أن يؤديها من خلال اتباع مميزة النزوح التحول الكيميائي للمجموعة وظيفية المقابلة "الاستشعار عن بعد" للتغيير في البيئة الكيميائية. في معظم الحالات، سواء NH والمجموعات الكيميائية CH يمكن استخدامها للإبلاغ عن تطور PTM من الفائدة.
يصف البروتوكول الحالي توليد جسيم نووي يحتوي على تفاضلي الهستونات شقيقة المسمى النظير. فهو يجمع بين المرونة في مطيافية الرنين النووي المغناطيسي لرسم خريطة PTMs باستخدام كل 1 ح 15 N و 1 ح 13 ج ارتباط الأطياف مع الاستفادة من مختلف العلامات البروتين تقارب لتنقية المجمعات هيستون المعاد المحدد. والجدير بالذكر أن يستخدم بروتوكول اثنين من تجمعات مختلفة من هيستون خاص لإعادة جسيم نووي. هذه المجمعات تفاضلي المسمى النظائر (واحد مع <suص> 15 N، والآخر مع 13 C)، وأنها تنصهر إلى polyhistidine وعلامة streptavidin تقارب، على التوالي. وجنبا إلى جنب تقارب نظام تنقية مع ني NTA واللوني القائم على streptavidin استخدمت في البداية من قبل فويت وآخرون. يعمل 7 لتنقية الأنواع غير المتماثلة من نظرائهم متماثل (الشكل 1A). تستخدم octamers هيستون غير المتماثلة في وقت لاحق لإعادة المجمعات nucleosomal أي ما يعادل (الشكل 1B)، وذلك باستخدام الملح القياسية طريقة غسيل الكلى 14. بالإضافة إلى ذلك، من خلال نفس الإجراء وجود واحدة من برك هيستون قبل تعديلها، وPTM يمكن إدراجها غير متماثلة على جسيم نووي الناتجة عن ذلك. رد فعل هذه ركائز باستخدام إنزيمات تعديل هيستون ولاحق NMR رسم خرائط للأحداث تعديل تمكين توصيف آليات الحديث المتبادل على حد سواء في رابطة الدول المستقلة (premodified نسخة هيستون) وفي العابرة (unmodifiإد هيستون نسخة) (الشكل 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
لإعادة جسيم نووي، البروتوكول الحالي يستخدم 165 نقطة أساس القالب الحمض النووي طويلة تحتوي على 601 ويدوم المواقع جسيم نووي تسلسل 20، ولكن من المتوقع أداء مماثل باستخدام أطوال مختلفة من قوالب الحمض النووي. تم تصميم بروتوكول ويعمل باستخدام أنواع غير المتماثلة …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بفضل مؤلف الدكتور فيليب Selenko (FMP-برلين) لتوفير مساحة الرطب مختبر والبنية التحتية لإجراء تجارب والألمانية للبحوث (DFG) لتمويل العمل من خلال منحة بحثية (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Unfolding Buffer | 7M guanidinium HCl | ||
| 20mM Tris pH7.5 | |||
| 10mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10mM Tris pH7.5 | ||
| 2M NaCl | |||
| 1mM EDTA | |||
| 2mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25mM NaxHxPO4 pH6.8 | ||
| 25mM NaCl | |||
| 2mM DTT | |||
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2HPO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6-8kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe |
Riferimenti
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).
- Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The Language of Histone Crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
- Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
- Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
- Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
- Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
- Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
- Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
- Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
- Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
- Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
- Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
- Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
- Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).
