Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni
Summary
Questo protocollo descrive la ricostituzione dei nucleosomi contenenti modo differenziale istoni sorella marcati con isotopi. Allo stesso tempo, nucleosomi asimmetricamente post-traduzionali modificati possono essere generati dopo utilizzando una copia istone premodified. Queste preparazioni possono essere facilmente utilizzati per studiare i meccanismi modifica diafonia, contemporaneamente su entrambi istoni sorella, utilizzando la spettroscopia NMR ad alta risoluzione.
Abstract
nucleosomi asimmetricamente modificati contengono le due copie di un istone (istoni sorella) decorati con distinte serie di modificazioni post-traduzionali (PTM). Essi sono di nuova specie identificate con mezzi sconosciuti di stabilimento e implicazioni funzionali. metodi di analisi attuali non sono sufficienti per rilevare la presenza specifica copia dei PTM sulle istoni sorella nucleosomal. Questo protocollo presenta un metodo biochimico per la ricostituzione in vitro di nucleosomi contenenti modo differenziale istoni sorella marcati con isotopi. Il complesso generato può essere anche asimmetricamente modificato, dopo tra cui una piscina istone premodified durante ripiegamento di Sottocomplessi istoni. Queste preparazioni nucleosoma asimmetriche possono essere prontamente reagito con enzimi istone modificanti per studiare i meccanismi di modifica di cross-talk imposte dal PTM asimmetricamente pre-incorporato usando la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). In particolare, le reazioni di modifica inin tempo reale può essere mappato in modo indipendente sui due sorelle istoni eseguendo diversi tipi di esperimenti di correlazione NMR, su misura per il tipo di isotopo. Questa metodologia fornisce i mezzi per studiare i meccanismi diafonia che contribuiscono alla formazione e propagazione di modelli PTM asimmetrici su complessi nucleosomal.
Introduction
DNA eucariotica è strettamente confezionato all'interno di nuclei cellulari in cromatina. L'elemento fondamentale della cromatina è la particella nucleo nucleosoma che contiene ~ 147 bp di DNA avvolto attorno ad un complesso octameric costituito da due copie ciascuna delle quattro istoni di base (H3, H4, H2A, H2B). proteine istoniche porto una pletora di modificazioni post-traduzionali (PTM). Queste sostituzioni covalenti inducono alterazioni nella struttura della cromatina, sia direttamente modificando la chimica fisica del sistema e, indirettamente, con l'assunzione di attività della cromatina-rimodellamento 1, 2, 3. Con tali mezzi, PTM istoni controllano cromatina accessibilità e, quindi, di regolare tutte le funzioni cellulari 4 basati sul DNA.
PTM vengono installati sistemi enzimatici istoni modificanti principalmente sui segmenti N-terminale non strutturati (code) di isto nucleo nucleosomi-incorporatones. A causa dei numerosi siti di modifica sulla relativamente breve sequenza di code degli istoni, PTM influenzano a vicenda inducendo o bloccando le reazioni successive di modifica, un effetto noto come modifica cross-talk 5. A causa della architettura simmetrica generale del nucleosoma, si pensava reazioni di modificazione e meccanismi di crosstalk a verificarsi in modo simile sui due copie di ogni istone nucleosomal (istoni sorella). Questo concetto è stato recentemente sfidato e successivamente smentita. In particolare, in vitro saggi enzimatici sulla libera istone H3 peptidi coda e sulle nucleosomi hanno dimostrato che una serie di chinasi H3 introdotto fosforilazione in maniera asimmetrica 6. Inoltre, l'analisi LC-MS / MS a base di affinità purificazione rivelato l'esistenza di nucleosomi asimmetricamente H3-metilato in diversi tipi di cellule eucariotiche 7. Così, nucleosomi asimmetricamente modificati costituiscono specie romanzo, egli strumenti sono necessari per scoprire i meccanismi che controllano la loro formazione e per analizzare gli effetti di crosstalk che questa asimmetria potrebbe esercitare.
Comunemente, Western Blotting (WB) e spettrometria di massa analisi (MS) sono stati utilizzati per rilevare PTM istoni. Nonostante la sua facilità di applicazione, WB soffre di problemi di specificità / cross-reattività. In cima a quello, è incapace di svolgere contemporaneamente analisi multi-PTM e la quantificazione diretta delle reazioni di modifica 8. D'altra parte, l'analisi MS impiega strumentazione sofisticata che richiede una formazione di alto livello, ma fornisce elevata specificità e mappatura simultanea e quantificazione di più PTMs 9. Tuttavia, entrambi i metodi sono dirompente e complessi nucleosomal sono dissociate prima dell'analisi, dando origine ad una miscela di istoni e / o peptidi istone-derivato. Questa manipolazione rimuove la capacità di distinguere indipendentiLe reazioni di modifica che si verificano su ciascuna delle due sorelle istoni e per segnalare lo stato di modifica specifica per copia degli istoni nucleosomiali.
Nucleare Risonanza Magnetica (NMR) evoluto come metodo alternativo per mappare reazioni PTM. NMR è senza interruzioni e quindi consente il monitoraggio di eventi PTM in modo tempo reale in miscele ricostituiti, e anche in cellule intatte 10, 11. Lo sviluppo delle routine di acquisizione dati veloce così come per la mappatura ad alta risoluzione sulla base 2D etero-nucleare metodi di correlazione di campioni marcati con isotopi (15 N e / o 13 C) 12 ha permesso la mappatura simultanea di diversi tipi di PTMs, tale come serina / treonina / fosforilazione della tirosina, lisina acetilazione / metilazione, e arginina metilazione 13. A seconda del PTM in esame, 15 N- o 13 C-etichettatura protocols possono essere impiegati per segnare il gruppo funzionale proteina che serve come reporter modifica. Di conseguenza, PTM mappatura può essere eseguita seguendo la caratteristica chemical shift spostamento del corrispondente gruppo funzionale 'sensing' alterazione sull'ambiente chimica. Nella maggior parte dei casi, sia NH e gruppi chimici CH possono essere utilizzati per segnalare l'evoluzione del PTM di interesse.
L'attuale protocollo descrive la generazione di nucleosomi contenenti modo differenziale istoni sorella marcati con isotopi. Esso combina la flessibilità della spettroscopia NMR alla mappa PTMs utilizzando sia 1 H- 15 N e 1 H- 13 C correlazione spettri con l'utilizzo di diversi tag proteine affinità per la purificazione dei complessi istone ricostituiti selezionati. In particolare, il protocollo si avvale di due diverse piscine di un particolare istone per la ricostituzione nucleosomi. Queste piscine sono differenziale marcati con isotopi (uno con <sup> 15 N, l'altro con 13 C), e sono fuse ad un polyhistidine e un tag streptavidina affinità rispettivamente. Uno schema di purificazione di affinità tandem con Ni-NTA e la cromatografia streptavidina basata inizialmente utilizzato da Voigt et al. 7 è impiegato per purificare specie asimmetrica controparti simmetriche (Figura 1A). Ottameri istone asimmetrici sono utilizzati successivamente per ricostituire complessi nucleosomal equivalenti (Figura 1B), utilizzando il metodo di dialisi del sale di serie 14. Inoltre, attraverso la stessa procedura e avendo una delle piscine istone pre-modificato, un PTM può essere incorporato in modo asimmetrico sui nucleosomi risultanti. La reazione di questi substrati con enzimi istone-modifica e successiva NMR-mappatura degli eventi di modifica consentono la caratterizzazione dei meccanismi di crosstalk sia in-cis (copia istone premodified) e in-trans (unmodifiistone copia ndr) (Figura 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Per la ricostituzione nucleosomi, l'attuale protocollo utilizza un modello di DNA lungo 165 bp contenente il 601-Widom sequenza di posizionamento nucleosoma 20, ma le prestazioni simile è previsto con diverse lunghezze di modelli di DNA. Il protocollo è stato progettato e impiegato utilizzando i tipi asimmetriche di istone H3. Con lo stesso principio, il metodo può essere applicato anche per gli altri istoni core e inoltre può essere usato per ricostituire complessi trasportano due istoni…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'autore ringrazia il Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlino) per la fornitura di spazio wet-lab e le infrastrutture per eseguire esperimenti e Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) per il finanziamento dell'opera attraverso un assegno di ricerca (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Unfolding Buffer | 7M guanidinium HCl | ||
| 20mM Tris pH7.5 | |||
| 10mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10mM Tris pH7.5 | ||
| 2M NaCl | |||
| 1mM EDTA | |||
| 2mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25mM NaxHxPO4 pH6.8 | ||
| 25mM NaCl | |||
| 2mM DTT | |||
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2HPO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6-8kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe |
Riferimenti
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