Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses
Summary
Wir beschreiben die Etablierung von orthotopen kolorektalen Tumoren durch Injektion von Tumorzellen oder Organoiden in den Cecum von Mäusen und die anschließende Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus diesem Modell.
Abstract
Trotz der Vorteile der einfachen Anwendbarkeit und der Kostenwirksamkeit haben subkutane Mausmodelle schwere Einschränkungen und simulieren die Tumorbiologie und die Verbreitung von Tumorzellen nicht genau. Orthotopische Mausmodelle wurden eingeführt, um diese Einschränkungen zu überwinden; Allerdings sind solche Modelle technisch anspruchsvoll, vor allem in Hohlorganen wie dem Dickdarm. Um einheitliche Tumore zu erzeugen, die zuverlässig wachsen und metastasieren, sind standardisierte Techniken der Tumorzellpräparation und Injektion kritisch.
Wir haben ein orthotopisches Mausmodell von Darmkrebs (CRC) entwickelt, das hochgradig einheitliche Tumore entwickelt und für Tumorbiologie-Studien sowie therapeutische Studien eingesetzt werden kann. Tumorzellen aus Primärtumoren, 2-dimensionalen (2D) Zelllinien oder dreidimensionalen (3D) Organoiden werden in den Cecum injiziert und bilden je nach metastatischem Potential der injizierten Tumorzellen hochmetastatische Tumore. In Ergänzung,CTCs können regelmäßig gefunden werden. Wir beschreiben hier die Technik der Tumorzellpräparation sowohl aus 2D-Zelllinien als auch aus 3D-Organoiden sowie primärem Tumorgewebe, chirurgischen und Injektionstechniken sowie der Isolierung von CTCs aus den tumortragenden Mäusen und präsentieren Tipps zur Fehlersuche.
Introduction
Darmkrebs (CRC) ist eine der häufigsten Ursachen für Krebs Tod in den westlichen Ländern. 1 Während der Primärtumor oft reseziert werden kann, verschlechtert das Auftreten von entfernten Metastasen die Prognose drastisch und führt oft zum Tod. 2 , 3 Das biologische Korrelat der Metastase ist zirkulierende Tumorzellen (CTCs), die sich vom Tumor lösen, im Kreislauf überleben, an das Epithel im Zielorgan anschließen, in das Organ eindringen und schließlich zu neuen Läsionen übergehen. 4 Obwohl CTCs bekanntermaßen von prognostischer Relevanz sind, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 wird ihre Biologie nur teilweise durch ihre extreme Seltenheit im CRC verstanden. 10
Mausmodelle sind ein leistungsfähiges tOol, um verschiedene Aspekte der Krebsbiologie zu studieren. Klassische, subkutane Tumormodelle werden durch subkutane Injektion von Tumorzellen in Empfängermäuse produziert, die entweder immunkompetent sein können (wenn syngene murine Tumorzellen verwendet werden) oder immundefizient sind. Subkutane Tumormodelle sind preiswert und produzieren schnell Daten; Ihr Endpunkt-Tumorwachstum kann leicht und nicht-invasiv gemessen werden. Allerdings scheitern 88% der neuen Verbindungen, die Antitumor-Aktivität in solchen Modellen gezeigt haben, in klinischen Studien. 11 Dies ist zum Teil auf interspezifische Unterschiede zwischen Menschen und Mäusen zurückzuführen; Allerdings ist ein großer Teil dieses Versagens auf den niedrigen prädiktiven Wert von subkutanen Mausmodellen zurückzuführen.
Orthotopische Mausmodelle, bei denen die Tumorzellen in das Herkunftsorgan injiziert und damit in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung wachsen, werden daher zunehmend in der Krebsforschung eingesetzt. 11 , 12 , </sUp> 13 , 14 Orthotopische Modelle simulieren nicht nur lokale Tumorwachstumsbedingungen; Als Ergebnis der anatomisch korrekten Ort des Tumorwachstums erlauben orthotopische Mausmodelle auch eine realistische Simulation der Metastasierung und werden daher zur Untersuchung der CTC-Biologie 8 , 15 , 16 oder ihrer Reaktion auf verschiedene Behandlungen im CRC verwendet. 13 , 17
Ein wesentlicher Nachteil von orthotopischen Mausmodellen ist ihre technische Komplexität. Je nach dem Organ, in dem die Zellen injiziert werden sollen, ist die Lernkurve, bis der Experimentator in der Lage ist, reproduzierbare Tumore zu induzieren, ziemlich lang. Dies gilt insbesondere für Darmkrebsmodelle, da die Tumorzellen in die Darmwand injiziert werden müssen, was oft zu Perforationen, Tumorzellleckagen oder endoluminalen Tumorzellverlusten führt. Dies einRtikel soll das Verfahren der Zellpräparation aus primären Gewebeproben, 2D-Zelllinien und 3D-Organoidkultur und deren Injektion in den Cecum von Mäusen beschreiben. Die hier beschriebene Technik führt zu hochgradig einheitlichen Tumoren und in Abhängigkeit von der Tumorbiologie der für die Injektion verwendeten Zelllinie eine reproduzierbare Bildung von entfernten Metastasen und CTCs in den Empfängermäusen. 15
Protocol
Representative Results
Discussion
Trotz ihrer präklinisch bewährten Aktivität bei subkutanen Mausmodellen scheitert die große Mehrheit der neuartigen Verbindungen in klinischen Studien und erreicht niemals die Klinik. 11 Diese offensichtliche Insuffizienz von subkutanen Mausmodellen zur genauen Simulation der Biologie und Wachstumsmuster von Tumoren hat zur Entwicklung von orthotopischen Mausmodellen geführt, die auf der Injektion von Tumorzellen direkt in das ursprüngliche Organ basieren.
Ortho…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der deutschen Forschungsstiftung (WE 3548 / 4-1) und der Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14) unterstützt.
Materials
| Cell culture Media and Components | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
| Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine | Temgesic | – | |
| Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
| Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
| Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
| HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
Riferimenti
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