ゴルジ - コックス法を用いた太い脳切片内のイメージングニューロン
Summary
我々は、単一の組織サンプル内に含まれる長い樹状ツリーとニューロンを可視化するために、厚い脳切片にゴルジコックス染色法を使用するためのプロトコルを提示します。このプロトコルの二つの変異体はまた、クレシルバイオレットの対比、および長期保存のために未処理の脳の凍結を伴うが提示されています。
Abstract
ニューロン染色のゴルジ – コックス方法は、組織学的脳サンプル内のニューロンの形態の我々の理解を進めるために以上の200年のために採用されています。それは完全に単一のセクション内に含まれる染色されたニューロンを同定する確率を高めるために、可能な最大の厚さで脳切片を調製するために実用的な観点から好ましいが、このアプローチは高いの作動距離によって技術的な観点から制限されています-magnification顕微鏡対物レンズ。ここでは500μmの厚さで切断されているマウスの脳切片にゴルジ – コックス法を用いた神経細胞を染色するために、高解像度30X 1.05 NAシリコーンを装着した正立顕微鏡を使用して、これらのセクションの深さ全体のニューロンを可視化するために、プロトコルを報告します800μmの作動距離を持つ油浸対物レンズ。また、表面を対比染色するために使用することができるこのプロトコルの2つの有用な変種を報告しますクレシルバイオレットニッスル染色で脳切片をマウントし、または処理を区画し、最終の前に長期保存のために全脳を凍結します。主プロトコルとその2つの変異体は、完全なニューロンの樹状ツリーと樹状突起棘を確実に可視化および定量化することができる全体ステンド厚い脳切片を、生成します。
Introduction
組織サンプル内の個々の神経細胞の可視化は、脳の我々の理解を進めて大きくしており、それは、内因性疾患または外因性の環境要因によって影響を受ける可能性がどのようにニューロンの形態学的特性のその場での分析を可能にします。ゴルジ – コックスの染色方法は、脳内の神経細胞のランダムなサンプルを染色の費用対効果の高い、比較的簡単な手段です。第ゴルジ1によって開発され、1800年代コックス2によって修飾、研究者らはさらに、樹状ツリー形態および棘密度3,4の両方を可視化し、定量化するために使用することができる透明な、十分に染色されたニューロンを産生するために長年にわたってこの技術を洗練しています5、6、7、8、9。
脳切片中の染色されたニューロンの可視化のための主要な技術的な考慮事項は、使用可能な高倍率/高解像度の顕微鏡対物レンズの作動距離によって制限される最大スライス厚、です。 60で共通の油浸対物レンズ – 100Xは、優れた分解能を提供する範囲であるが、一般的には200μmよりも大きくない彼らの作動距離によって制限されています。 200μmの範囲で切断脳切片は、大脳皮質10の浅い層で例示錐体ニューロン、11、12、のCA1領域における錐体ニューロンのために、このスライスの厚さ内に収容することができる特定のニューロンタイプを視覚化するのに十分であってもよいです海馬13、14、及び海馬15の歯状回における顆粒細胞。比較的長いとニューロンこうした脳は全体の樹状突起の木を含むように完璧な角度で切断する必要があるため、セル本体16から800以上ミクロンを拡張することができ、マウスのために、より大きな挑戦を提供大脳皮質の深い層内の錐体細胞として樹状突起、 200枚のμmの切片内。デンドライトまたはその枝のいずれかが吻側または尾側方向に延びている場合、これはさえ実現可能ではないかもしれません。それは複数の隣接する脳切片を横切ってニューロンを追跡することによってこの制限に対処することは可能であるが、このアプローチは17をトレースするための正確セクションを整列させるに重要な技術的課題を紹介します。より実用的なアプローチは、より大きな厚さで切断された脳切片内に含まれる全体のニューロンを可視化することであろう。
ゴルジ – コックス法を用いたマウスの500ミクロン厚の脳切片、および彼らのMOを視覚化するために – 私たちはここに400内のニューロンを染色する技術を報告しますrphology800μmの作動距離を有する高分解能シリコン油浸対物レンズを使用。我々は説明ゴルジコックス含浸処理プロトコルは文献6に最も引用現代プロトコルのいずれかから変更されています。厚い脳切片との我々のアプローチは、完全にセクション内に含まれる任意のタイプのニューロンを同定する確率を増加させるという利点を提供します。ユニークな利点を提供するメインプロトコル、我々もまた、本2つのバリエーションに加えて：取り付けられた部分の表面にクレシルバイオレット対比（1）ゴルジコックス染色、脳領域の境界を画定するための層を識別するために切片および最終処理の前に含浸全脳の長期保存のための中間凍結ステップと大脳皮質、及び（2）ゴルジコックス染色。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、厚い脳切片内の神経細胞を可視化するために、ここで2つの有用な変種と一緒にゴルジコックスの染色プロトコルを記述します。代表的な結果に示すように、長い800μmの作動距離を持つ高解像度の対物レンズの使用は、500μmので切断脳切片の深さを通して全体ニューロンの信頼性の可視化が可能になります。比較的厚い脳切片のこの研究では、任意のタイプの染色されたニューロン…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、自然科学とカナダ（NSERC）の工学研究会、イノベーションのためのカナダ財団（CFIプロジェクト番号30381）からCDCBへジョンR.エバンスリーダー基金研究基盤の助成金、およびによってからCDCBにディスカバリーグラントによってサポートされていましたNSERCからNJMに発見グラント。 ELLオンタリオ大学院奨学金によっておよびゲルフ大学のオンタリオ獣医大学からOVC奨学金によってサポートされていました。 CDSはNSERCからの学部学生の研究助手によってサポートされていました。 ALMはNSERCからアレクサンダー・グラハム・ベル奨学金によっておよびゲルフ大学のオンタリオ獣医大学からOVC奨学金によってサポートされていました。
Materials
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | also known as 2-methylbutane. Hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6 well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde, 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4x microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10x microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30x microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60x microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
Riferimenti
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