Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Summary

Dit protocol beschrijft een methode voor de snelle verwerking van post-mortem diffuse intrinsieke pontijnse glioom monsters voor de oprichting van de patiënt afgeleide celcultuur modellen of directe karakterisering van tumor en micro-omgeving van de cellen.

Abstract

Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG) is een kindertijd hersenstam tumor die een universeel fatale prognose draagt. Omdat chirurgische resectie is geen haalbare behandelingsstrategie en biopsie wordt niet routinematig uitgevoerd, de beschikbaarheid van de patiënt monsters voor onderzoek is beperkt. Bijgevolg hebben de inspanningen om deze ziekte te bestuderen uitgedaagd door een gebrek aan trouwe ziekte modellen. Om hieraan te beschrijven we hier een protocol voor de snelle behandeling van post-mortem autopsie weefselmonsters teneinde duurzame patiënt afgeleide celcultuur modellen die kunnen worden gebruikt bij in vitro proeven of in vivo orthotope xenograft experimenten genereren. Deze modellen kunnen worden gebruikt om te screenen op mogelijke therapeutische doelwitten en fundamentele processen in pathobiological DIPG bestuderen. Dit protocol kan verder worden uitgebreid om te analyseren en te isoleren tumor micro-omgeving van de cellen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), die verdere analyse van gen ex maaktpression, eiwitexpressie of epigenetische modificaties van DNA bij de bulk cel of single cell niveau. Tenslotte kan dit protocol worden aangepast aan patiënt afgeleide culturen andere centrale zenuwstelsel tumoren genereren.

Introduction

DIPG is een agressieve centrale zenuwstelsel maligniteit die ontstaat in het ventrale pons, meestal in het middenseizoen jeugd ^{1, 2.} Ondanks uitgebreide klinische studies huidige behandelingen beperkt tot bestraling door tijdelijke verbetering of stabilisatie van de symptomen biedt en zich slechts mediane overleving met gemiddeld 3 maanden. Zelfs met radiotherapie, mediane overleving is slechts 9 maanden met 90% van de kinderen sterven aan de ziekte binnen 2 jaar na de eerste diagnose. Vanwege de infiltratieve aard van de tumor en de kritische functies van de hersenstam, chirurgische resectie niet mogelijk. Bovendien is in de Verenigde Staten, het verkrijgen chirurgische biopten voor DIPG historisch niet uitgevoerd ^3, als histopathologische analyse heeft geen lopende rol in de begeleiding klinische behandeling en diagnose kan typisch door alleen neuroimaging. Zo is de beschikbaarheid van tumorweefsel fof studie is beperkt, het beperken van de inspanningen om het onderzoek naar kandidaat-medicijn moleculen en de onderliggende tumor biologie te voeren. Met name verbetering van beeldvormende en stereotactische technieken hebben geleid tot de ontwikkeling van veilige biopten van DIPG afgelopen jaren ^4, die, in combinatie met vooruitgang in de moleculaire biologie hebben ons begrip van de ziekte getransformeerd. Op dit moment, meerdere klinische proeven met upfront biopsie en moleculaire profilering van DIPG te individualiseren behandeling plannen zijn aan de gang (NCT01182350, NCT02274987) ^5.

DIPG en andere pediatrische hooggradig glioom vertegenwoordigen onderscheiden ziekten van hun volwassen tegenhangers glioblastoma ^{6, 7} en dus getrouwe experimentele modellen van DIPG nodig zijn unieke pathofysiologie begrijpen ontdekken effectieve therapeutische strategieën. In de afgelopen jaren, pogingen gericht verkrijgen DIPG tumor tkwestie voor onderzoek bij de autopsie of, minder vaak, biopsie hebben ons begrip van en het vermogen om DIPG bestuderen revolutie. Genoombrede sequencing inspanningen bleek een terugkerende mutatie in de H3 histon familie 3A (H3F3A) en histon cluster 1, H3b (HIST1H3B), die het eerste voorbeeld van menselijke ziekte veroorzaakt door mutaties in histon coderende eiwitten ^{8, 9, 10, 11} . Verder is een subset van DIPGs drukt mutaties in het ACVR1 gen, die niet eerder zijn gerapporteerd bij kanker maar zijn identiek aan mutaties in de kindertijd aangeboren ontwikkelingsstoornis fibrodysplasia ossificans progressiva ^{8, 9, 10, 11.} Als goed, de eerste patiënt afgeleid DIPG celculturen en orthotope xenograft models zijn inmiddels vastgesteld ^{1, 2, 12, 13, 14,} evenals muismodellen door de directe xenotransplantatie van tumorcellen gevestigde immunodeficiënte muizen serial xenotransplantaten genereren ^{3, 14, 15.} Initial drug discovery inspanningen met behulp van deze patiënt afgeleide modellen hebben geïdentificeerd veelbelovende nieuwe middelen voor klinische vertaling ^{4, 14} en hebben de basis gelegd voor ten minste één klinisch onderzoek (NCT02717455).

Deze eerste stappen in de richting van de vooruitgang zijn slechts het begin, en tal van patiënt afgeleide weefselmonsters en cultuur modellen zal nodig zijn om subtypes van de ziekte te bepalen en ontwikkelen van de meest effectieve therapeutische strategieën. genetisch engineEred muismodellen van DIPG zal ook gemakkelijker studies die gericht zijn op het bevorderen van onze fundamentele begrip van de ziekte. Pogingen om genetische modellen voor DIPG genereren wordt geholpen door de fundamentele genomische studies hierboven besproken, maar momenteel een beperkt aantal opties beschikbaar. Een dergelijk model, dat histologisch vergelijkbaar hoogwaardige hersenstam glioom genereert, wordt de virale RCAS / tv-systeem aan PDGF-B overexpressie en Ink4a-ARF verlies rijden nestine-positieve cellen in de fossa posterior van neonatale muizen ^{5, 16.} Een andere benadering omvat indient verscheidene zware DIPG geassocieerde mutaties (histone H3.3 K27M mutatie p53 verlies en PDGFRA activering) in neurale voorlopercellen afkomstig van menselijke embryonale stamcellen, die voldoende is om deze cellen tumorigene ^{6, 7, 17} maken. De combinatie van genetische methoden en patiënt-derived modellen zullen preklinische testen mogelijk te maken en bevorderen de ontwikkeling van effectieve therapieën.

De uitdagingen DIPG onderzoek hierboven beschreven pakken, werd deze snelle obductieprotocol ontwikkeld patiënt afgeleide celculturen voor het onderzoek ^{8, 9, 10, 11, 12, 14} genereren. Het protocol is bedoeld om de levensvatbaarheid van het weefsel te beschermen en de kans op het genereren van duurzame culturen, ondanks de uitdagingen in verband met uitgebreide post-mortem intervallen en transport te maximaliseren. Bij succes geproduceerd, kunnen deze DIPG kweken worden gebruikt in volgende in vitro manipulaties en in vivo xenograft experimenten, waardoor evaluatie van potentiële therapeutische moleculen op patiënt afgeleide cellen.

Protocol

Dit protocol is uitgevoerd met de goedkeuring van onze institutionele review board met geschikte de-identificatie van alle patiëntgegevens en in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn. Het verkrijgen van de nodige institutionele review board goedkeuring en geïnformeerde toestemming van de familie van de patiënt voorafgaand aan het werken met dit protocol. 1. Het verkrijgen van weefselmonsters LET OP: Een cruciaal onderdeel van dit protocol vereist een goede afhandeling van de weefseldonatie met onmiddellijke ingang op het moment van de autopsie. De totale steekproef levensvatbaarheid is sterk afhankelijk van het minimaliseren van de Post-Mortem Interval (PMI), onmiddellijk overbrengen van het weefsel in de juiste koude medium aangevuld met antibiotica / antimycotica, het bijhouden van het monster op nat ijs gedurende het vervoer, en het handhaven van de steriele techniek in het hele protocol. na kennisgevingvan een op handen zijnde schenking, voor te bereiden een monster collectie kit. Met behulp van een scheepvaart doos met een geïsoleerde container die direct kunnen worden gebruikt voor de terugkeer transport van het weefselmonster, onder meer de volgende materialen: Omvatten materialen voor steriele bereiding, met inbegrip van steriele handschoenen, gordijnen, en scalpels. Omvatten 8-10 steriele 50 ml conische buizen met 30 ml scheepvaart media in de geïsoleerde container met ijs of koude packs. LET OP: Hoewel elke standaard celcultuur media kan werken, is de beste monster levensvatbaarheid verkregen met Hibernate-A, aangevuld met antibioticum / antimycoticum. Omvatten verdere monster buizen voor andere analyses (bijv fixatieven). Als de autopsie niet zal worden uitgevoerd op de site van de onderzoeker, zijn voorzien van een document waarin duidelijk staat hoe de tumor monster te verzamelen. Deze bevat details, zoals het handhaven van steriliteit, waardoor monsterbuizen op nat ijs, en met inbegrip van monsters van de middenhersenen en merg als tumor cellen binnenvallen vaak deze regio's. Handhaving van de steriliteit tijdens de autopsie. Denk aan de hersenen steriele binnen de schedel, zo observeren steriele techniek (met inbegrip van het veranderen van handschoenen) zodra de schedel is geopend. Zodat verontreiniging met huid en haar kritisch. Ontleden de tumor uit de ventrale zijde (de "buik" van de pons, zie Supplemental figuur 1). Met een steriele scalpel, snijd kleine 1 cm stukjes van de tumor en direct overdragen in koud verzending media (zie opmerking in stap 1.1.2) en op nat ijs. Breng 10 ml van weefsel in elke buis, wat resulteert in een uiteindelijk volume weefsel media in elke buis van 40 ml. OPMERKING: Bij DIPG, de tumor infiltreert diffuus pons en vaak de rest van de hersenstam. Als zodanig verzamel zoveel van het monster mogelijk, dat typisch 3-4 tubes (30 – 40 ml weefsel) van pons en 1-2 buizen (10-20 mL weefsel) van middenhersenen en medulla. Verzamel samselen van de middenhersenen en medulla geplaatst naast de pons, die vaak bevatten veel tumorcellen. Na de monstername, het schip de monsters O / N op nat ijs in de geïsoleerde container. Verschepen niet het monster op droog ijs, zoals het bevriezen van de cellen te doden. 2. Voorbereiding voor het monster verwerking Voorafgaand aan het begin monstervoorbereiding, steriliseren weefselkweek kap met scheermesjes, gebogen hemostats, en andere niet-steriele instrumenten onder UV licht gedurende 1 uur. Voer alle volgende stappen onder steriele omstandigheden om besmetting van de kweken te voorkomen. Bereid en steriele filter oplossingen. Tot 1,8 M sucrose oplossing te bereiden, te ontbinden 308,07 g sucrose in 300 ml gedestilleerd water. 50 mL voeg 10x Hank's-gebufferde zoutoplossing (HBSS) zonder calcium of magnesium en brengt totale volume 500 ml met gedestilleerd water. Bewaren bij 4 ° C. Enzymatische vertering te bereiden, neem 50 ml HBSS met calcium en magnesium voor elke 10 ml gehakt weefsel en voeg 500 ul 5 mg / ml deoxyribonuclease I (eindconcentratie 50 gg / ml), 500 pl 2,5 mg / ml collagenase I / II en Dispase-oplossing (eindconcentratie 25 ug / ml) en 500 gl 1 M HEPES-buffer. Voorverwarmen spijsvertering oplossing in een 37 ° C waterbad. Om tumorstamcellen media (TSM) voor te bereiden die, meng 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), 5 ml 100x antibioticum-antimycoticum, 5 ml 200 mM L-alanyl-L- glutamine dipeptide (GlutaMAX-A), 5 ml HEPES-buffer, 5 ml 100 mM natriumpyruvaat en 5 ml 100x MEM niet-essentiële aminozuren. Om compleet TSM bereiden met groeifactoren, voeg de volgende aanvullingen op TSM basis: 50x B27 Supplement Minus Vitamine A (1:50), de menselijke epidermale groeifactor (H-EGF, 20 ng / ml), de menselijke fibroblast groeifactor (H- FGF, 20 ng / ml), humaan bloedplaatjes afgeleide groeifactor AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml),menselijke bloedplaatjes afgeleide groeifactor BB (H-PDGF-BB, 10 ng / ml) en heparine-oplossing (2 ug / ml). Voorkoelen een laboratorium centrifuge uitgerust met een swinging-bucket rotor bij 4 ° C. 3. mechanische Dissociatie Breng het weefsel in een high-ommuurde 100 mm x 20 mm celkweek schotel. Verwijder media overblijfsel uit de scheepvaart en te vervangen door 10 – 15 ml koud kweekmedium. Met behulp van de gebogen hemostats te vatten een scheermesje, gehakt het weefsel fijn tijdens het verwijderen van de hand liggende bloedvaten of hersenvliezen. LET OP: De laatste weefsel fragmenten moet kleiner zijn dan 1 mm (zie figuur 1B). Breng het weefsel in een schone 50 ml conische buis. Was de celkweekschaal met 5 ml koud kweekmedium en plaats het conische buis. Herhaal deze wasstap als nodig is om de resterende weefsel te dragen. Met behulp van een 10 ml serologische pipet zachtjes vermaal (4-5 keer). Laat grotere tissue fragmenten naar de bodem van de buis. Eventueel kort centrifugeren van het monster gedurende 1 minuut (350 xg, 4 ° C). Verzamel de mechanisch gescheiden fractie. Verwijder de supernatant en filtreer het door een 100 urn filter in een nieuwe 50 ml conische buis met het label "mechanische dissociatie." Keer de filter over de oorspronkelijke conische buis en was met de cultuur media om weefsel fragmenten te herstellen. Centrifugeer de "mechanische dissociatie" fractie gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). Verwijder de bovenstaande vloeistof uit het ingehulde "Mechanische dissociatie" fractie en resuspendeer het weefsel in koud kweekmedium. Als er meer dan 5 ml van weefsel in de "mechanische dissociatie" conische buis, splitsen de andere weefsel in 50 ml conische buizen zodat geen buis meer dan 5 ml weefsel. Bewaar de mechanisch gedissocieerde fractie op ijs tot de sucrose gradiënt centrifugeren stap (Step 5). Als alternatief kan de mechanisch gedissocieerde fractie verder met stap 5 tijdens de enzymatische dissociatie incubatietijd (stap 4.4). 4. Enzymatische dissociatie Als er meer dan 5 ml van weefsel in de buis met de grotere resterende weefsel fragmenten gesplitst weefsel in de andere nieuwe 50 ml conische buizen zodat geen buis meer dan 5 ml weefsel. Centrifugeer de conische buis (buizen) die het resterende weefsel fragmenten gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). Verwijder de supernatant en voeg de voorverwarmde enzymatische digestie oplossing, zodat er 5 ml verteringsoplossing voor elke 1 ml weefsel (bijvoorbeeld 25 ml digestie oplossing voor 5 ml weefsel). Dicht de conische buis met deksels laboratorium film en incubeer de reactie op een rotator bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Na de incubatie vermaal de monsters voorzichtig (zie figuur 1C). Met behulp van een 10 ml serologische pipet,pipet het monster op en neer 6-8 keer. Vermijd het genereren van overmatige luchtbellen. Voeg 1000 ul pipet tip aan het eind van de pipet en vermaal nog eens 6-8 keer. Sta resterende brokken naar de bodem van de buis. Verwijder het supernatant filter met de cellen nog steeds onderbroken door een 100 urn filter in een nieuwe 50 ml conische buis met het label "Enzymatische dissociatie" en bewaar op ijs. Bij aanzienlijke weefselfragmenten blijven, voeg nog eens 10 ml HBSS met calcium en magnesium om de fragmenten en herhaal stappen 3.5.1 en 3.5.2. Filter deze laatste oplossing door een 100 pm filter in de "enzymatische dissociatie" tube. Centrifugeer de "enzymatische dissociatie" buis gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C) en blijft sucrosegradiënt centrifugatie. 5. sucrosegradiënt Centrifugeren Indien monsters nog steeds worden gesuspendeerd in oplossing, centrifugalege gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). Verwijder het supernatant en resuspendeer weefsel in 20 ml koude HBSS zonder calcium en magnesium. Breng het volume tot 25 ml totaal met koud HBSS. Voeg langzaam 25 ml 1,8 M sucrose-oplossing en keren de buis te mengen. Dit resulteert in een 0,9 M sucrose gradiënt. Centrifuge zonder rem voor 10 min (800 x g, 4 ° C). Middels een centrifugering rem verloop verstoren en de opbrengst verlagen (zie figuur 1D voor een voorbeeld van een monster voor en na centrifugeren). Zorgvuldig aspireren myeline puin en zoveel sucrose oplossing mogelijk. Was het monster door het toevoegen van 30 ml koud HBSS zonder calcium en magnesium en het mengen voorzichtig. Centrifugeer gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). 6. ACK Red Blood Cell Lysis Verwijder het wassen supernatant. Voeg 5 ml ACK-lysisbuffer en voorzichtig resuspendeer de celpellet, zwenken de buis gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Quench de llyse door toevoeging van 30 ml koude HBSS zonder calcium en magnesium. Centrifugeer gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). 7. Initial Cultuur Onderhoud Resuspendeer de uiteindelijke celpellet in 10-15 ml warm compleet TSM met groeifactoren en kwantificeren levensvatbare celdichtheid op een hemocytometer behulp van trypan blauw exclusie. LET OP: Het bereik van levensvatbare cellen varieert sterk afhankelijk van de omstandigheden van het weefsel donatie en kwantificatie kan moeilijk in dit vroege stadium te wijten zijn aan overgebleven cellulaire puin. In het ideale geval, gericht op een miljoen levende cellen per monster te hebben. In gevallen waarin buitensporige puin blijft plaat bij een lagere dichtheid in een T175 kolf. Breng de laatste celsuspensies om een ​​nieuwe T75 kolf. Aar extra groeifactoren om de dag algemeen groeifactor te handhaven, en toezien op de ontwikkeling van tumorcellen neurosferen (zie figuur 1E en figuur 2). Alternatief proces enzymatisch gedissocieerde cellen voor verdere analyse, waaronder flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering. Na de ontwikkeling van neurosferen (die duurt gemiddeld 3-4 weken, maar varieert van een paar dagen zolang 2 maanden), omkeringsfilter het monster met een 100 um nylon zeef om de hoeveelheid afval te verminderen. NB: Het filtraat moet in de cultuur in het geval worden gehandhaafd levensvatbare enkele cellen of kleine bolletjes aanwezig zijn. De integriteit en zuiverheid van de cultuur door het uitvoeren van DNA-vingerafdrukken tijdens passage, in vergelijking met de oorspronkelijke patiëntmonster.

Representative Results

De beschreven protocol wordt samengevat als een vijf stappen workflow met afbeeldingen het weefsel bij verschillende bewerkingsstadia in figuur 1. Het monster wordt eerst verkregen door snelle steriele autopsie. Bij mechanische dissociatie wordt het weefsel fijngehakt tijdens het verwijderen van bloedvaten en hersenvliezen uit het monster, en gefiltreerd door een 100 um nylon zeef. Resterende weefsel fragmenten worden enzymatisch gedissocieerd in een opwarming oven. Vervolgens wordt afval verminderd door sucrosegradiënt centrifugatie, isoleren van een afzonderlijke laag van myeline van het monster. Bovendien ACK lysis zichtbaar vermindert de hoeveelheid rode bloedcellen in het monster. Tenslotte worden de cellen uitgeplaat in serum-vrij medium aangevuld met groeifactoren. Aanvullende Figuur 1 is een voorbeeld van de tumor bij autopsie. De tumor groeit als een diffuse infiltratie van de pons eend de aangrenzende gebieden van de hersenstam. Tijdens de steekproef voorbereidingen, moet klein ~ 1 cm x 1 cm stukjes worden gesneden en onmiddellijk in koud verzending media op ijs geplaatst. Figuur 2 toont verscheidene voorbeelden van hoe de monsters kan blijken uit de vroege stadia van het kweken van een duurzame cultuur. Aanvankelijk bedekt en vroege culturen (A, B) vaak niet te veel overlevende cellen bevatten. De vroegtijdige celclusters (C, D) vaak niet de mate van contrast doorgaans geassocieerd met neurosferen vertonen. Met name kan de duur van de tijd in de cultuur voorafgaand aan de verschijning van de cel clusters weken tot een paar maanden. Echter, de initiële passage van deze celgroepen, gecombineerd met reverse filtering van celgroepen, isoleren gezonde tumorcellen die kunnen bollen (F) vormen. Het filtraat (E) bevat meestal overgebleven puin; Toch raden we plating en onderhouden van het filtraat en monitoring voor de ontwikkeling van celgroepen. Deze patiënt afgeleide monsters kunnen vervolgens in de cultuur voor meerdere passages (G, H) worden gehandhaafd. Figuur 3 toont het vermogen van deze cellen xenotransplantatie worden in muizen. In elk van deze gevallen werden de DIPG cellen getransfecteerd met GFP-Luciferase reporter te zien op de ontwikkeling van tumoren door middel van bioluminescentie (A). De tumoren kunnen histologisch worden onderzocht, bijvoorbeeld tumor engraftment (B) of expressie van specifieke markers (C) neemt. Deze in vivo modellen, samen met in vitro testen kunnen worden gebruikt om de effecten van verschillende geneesmiddelen of gen manipulaties beoordelen (bijvoorbeeld 8, 9, 10, 11, 14). les / ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg "/> Figuur 1. Tissue Monsters in verschillende stadia van verwerking. (A) Verkrijgen van het monster door steriele autopsie procedures en s nachts de scheepvaart op nat ijs. (B) Van links naar rechts: (rij 1) buisjes met tumorweefsel in de scheepvaart media; verse weefsel in een 100 mm x 20 mm celkweek schotel; aanvankelijke hakken van het weefsel; (Rij 2) gedeeltelijk gehakt weefsel; verwijdering van de hersenvliezen en bloedvaten; uiteindelijke grootte van gehakt weefsel stukken. (C) Van links naar rechts: (rij 1) weefsel geïncubeerd op een roterende tafel in een 37 ° C oven; (Rij 2) aanwrijven van weefsel door een 1000 pi pipet tip bevestigd aan een 10 ml pipet; filtering van gedissocieerde weefsel door een 100 um nylon mesh filter. (D) Van links naar rechts: gedissocieerde weefsel gesuspendeerd in 0,9 M sucrose oplossing voorafgaand aan centrifugeren; gedissocieerde weefsel gescheiden over een sucrosegradiënt na het centrifugeren; een zichtbare laag of myeline puin bovenop de sucrosegradiënt; een uiteindelijke celpellet na ACK lysis en wassen. (E) De uiteindelijke steekproef kan in cultuur worden gebracht of worden gebruikt in andere downstream-analyses. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2. Beelden van primaire culturen en Early Passage Cells. (A – B) Culturen vergulde direct na dissociatie (SU-DIPG-XXX, A), of die nog niet gegroeid neurosferen (SU-DIPG-XXIX, B). (C – D) vroege verschijning van neurosferen in primaire SU-DIPG-XXVIII (C) en SU-DIPG-XXIX (D). (EF) Eerste doorgang van de primaire kweek van D met behulp van een 100 urn nylon filter, met de filtraat (E) en reverse filtraat (F) verzilverd. (G – H) Mature neurosferen uit de eerste passage van SU-DIPG-XXVII (G) en de derde doorgang SU-DIPG-XXV (H) groeien in kweek. Schaal bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3. Patient afgeleid celkweken engraft en Form tumoren bij muizen. (A) Bioluminescentie beelden van vier verschillende patiënt afgeleide celkweken getransfecteerd met een GFP-Luciferase reporter. (B) sagittale doorsnede van een muis xenograft, tonen tumorcellen geënt in de muis pons. Groen: GFP, Red: Myelin basic protein. Schaal bar = 1 mm. (C) Voorbeeld immunofluoresimage centie tonen GFP tumorcellen geënt in een muis hersenen. Blauw: DAPI, Groen: GFP, Rood: IGF2R. Schaal bar = 40 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende Figuur 1. Autopsie Voorbeeld van een Pontine Tumor. Onmiddellijke post-mortem uiterlijk van een diffuse intrinsieke pontine glioma. De tumor wordt weergegeven als een grote, myeline-rijke massa op het ventrale oppervlak van de pons. Klik hier om download dit beeld.

Discussion

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de snelle behandeling van post-mortem tumorweefsel donaties patiënt afgeleide celculturen ontwikkelen die kan worden gebruikt in een verscheidenheid van in vitro of in vivo experimenten. Vanwege de aard van het werken met autopsie monsters handhaven sample levensvatbaarheid moeilijk na. Verscheidene factoren, waaronder de post-mortem autopsie interval of de tijd die nodig is voor het transport van weefsel, worden zo beperkt mogelijk, maar vaak moeilijk te controleren. In onze ervaring, een postmortem interval van minder dan 6 – 8 uur (vanaf het moment van overlijden naar de tijd dat het weefsel wordt geplaatst in ijskoud scheepvaart en transport media) heeft de beste kans van de oprichting van een duurzame celcultuur opgeleverd. Het beste is om vervolgens het weefsel in het laboratorium ontvangt binnen 24 uur, en het verwerken van het voor de cultuur direct na ontvangst.

Aangezien de locatie van deze zeldzame gevallen varieert sterk, ende kwaliteit van het weefsel ophalen stap de slaagkans sterk beïnvloedt, kan de logistiek van het uitvoeren van de autopsie uitdagend. In veel gevallen, om de 6-8 uren periode te kunnen realiseren, is het niet haalbaar om het weefsel oogst voeren op academisch centrum. In plaats daarvan, met een tissue recovery service op afroep om de tumor weefsel te herstellen op de begrafenis thuis in het kader van een IRB-goedgekeurde protocol is vaak meer opportuun voor weefselherstel. Het verkrijgen van geïnformeerde toestemming vooraf van de dood wordt aanbevolen en vergemakkelijkt de logistieke planning. Het voorbereiden van self-contained autopsie kits met duidelijke en gedegen instructies en steriel benodigdheden voor tissue retrieval (handschoenen, gordijnen, scalpels) wordt sterk aanbevolen. Bovendien, het vaststellen van duidelijke punten van de communicatie tussen de onderzoeker, patholoog, en rouwcentrum is van cruciaal belang. Zo moet de onderzoeker het protocol met de patholoog voor de autopsie bespreken en markeer voorkomende fouten. Deze fouten zijn microBIAL contaminatie (meestal gist) tijdens weefsel retrieval, het niet het schip door middel van 's nachts / Verzending en het niet het monster op voldoende nat ijs schip in een thermoinsulated container. Tot slot raden we het gebruik van een deur-tot-deur-koeriersdienst voor verzending van het monster om het transport te minimaliseren.

Zorg moet ook tijdens weefsel dissociatie worden genomen om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Bijvoorbeeld, het gebruik van media ontworpen om neuraal weefsel gezondheid te behouden voor transport (sluimerstand-A aangevuld met antibiotische / antimycotische) de kans op het genereren van een succesvolle kweek te verhogen. Het is ook belangrijk om het monster bij een lage temperatuur in het protocol te houden door steeds overbrengen van de monsters op ijs. Verzamelen zowel mechanische en enzymatische dissociatie fracties met tritureren minimaliseren kan protocol succes te vergroten, aangezien beide stappen traumatisch cellen. In onze ervaring, terwijl de meeste succesvolle culturen groeien van beide fractiesHebben we gevallen waarin slechts één van de twee preparaten opgenomen duurzame cultuur, mogelijk als gevolg van de delicate aard van deze monsters hadden. Een andere traumatische stap in het protocol is wrijven; een strategie die de mate van trituratie noodzakelijk kan verminderen is te zorgen voor de monsters grondig gemalen aan het begin van het preparaat. Andere voorbeelden van aspecten van het protocol bedoeld om het monster rentabiliteit te verbeteren onder meer het toevoegen van buffers (bijv HEPES) in het gehele protocol, dat is vooral van belang tijdens de enzymatische dissociatie.

Een mogelijke wijziging van het protocol om cellevensvatbaarheid verder te verhogen is het verwijderen van de ACK rode bloedcellen lysisstap. In dit geval is vaak het nodig om een ​​ACK lysis stap uit te voeren tijdens de eerste week in kweek om rode bloedcellen te verwijderen. Een ander aspect van dit protocol kan worden aangepast is de eliminatie van myeline en celresten met een sucrose dichthy verloop. Specifiek andere strategieën die zijn gemeld levensvatbaarheid van de cellen van microgliacellen verbeteren zijn ook mogelijk bij deze stap, zoals een discontinue Percoll-dichtheidsgradiënt ¹⁸ of magnetische myeline verwijderen kralen.

Tenslotte overschilderen oorspronkelijke weefsel dissociatie en het verschijnen van neurosferen varieert tussen monsters en kan variëren van een week tot een maand of meer. Aangezien de aanvankelijke kweken bevatten gewoonlijk een aanzienlijke mate van dode cellen en celresten, kan het lastig zijn om te bepalen of levensvatbare cellen blijven; de kweek moet worden gehandhaafd gedurende ten minste 4-8 weken (figuur 2). Een strategie voor het isoleren groeiende cellen uit het resterende vuil wordt hier gepresenteerd (bijvoorbeeld omgekeerde filtreren celgroepen en opnieuw uitplaten in vers medium). De beslissing over de vraag of door te gaan met een cultuur te handhaven is uiteindelijk een case-by-case beslissing op basis van factoren omliggende the autopsie (bijvoorbeeld een langdurige postmortem interval, problemen tijdens weefsel transport), het weefsel dissociatie (bijvoorbeeld overmatig bloed of puin), en hoe de sample verschijnt in de cultuur. Zodra een cultuur is gebracht, moet de identiteit worden bevestigd met behulp van DNA-vingerafdrukken short tandem repeat analyse of een soortgelijke werkwijze, vergelijken de kweek een monster van de oorspronkelijke tumor behouden hiervoor. We raden u aan regelmatig valideren van culturen door middel van DNA-fingerprinting om ervoor te zorgen dat er geen verontreiniging met andere culturen heeft plaatsgevonden, bijvoorbeeld elke 3-6 maanden.

Het genereren van deze patiënt afgeleid DIPG culturen is een belangrijke stap in de succesvolle ontwikkeling van effectieve therapieën. De uitbreiding van de beschikbare-patiënt afgeleid DIPG culturen en xenograft modellen zullen van cruciaal belang voor het identificeren van de meest effectieve therapeutische strategieën en uiteindelijk overwinnen van deze verwoestende ziekte.

Materials

Hibernate-A	Gibco	A12475-01
HBSS with Calcium/Magnesium	Gibco	24020-117
HBSS	Corning	21-022-CV
HEPES	Gibco	15630-080
Liberase DH (Collagenase/Dispase)	Roche	5401054001
DNAse I	Worthington Biochemical	LS002007
Sucrose	Sigma	S0389
Antibiotic/Antimycotic	Gibco	15240-096
Neurobasal-A	Gibco	10888-022
DMEM/F12	Gibco	11330-032
GlutaMAX-I (100X)	Gibco	35050-061
Sodium Pyruvate (100mM)	Gibco	11360-070
B27 Supplement Minus Vitamin A	Gibco	12587-010
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco	11140-050
Human PDGF-AA	Shenandoah Biotechnology	100-16
Human PDGF-BB	Shenandoah Biotechnology	100-18
Human EGF	Shenandoah Biotechnology	100-26
Human FGF	Shenandoah Biotechnology	100-146
Sterile scalpel blades	Bard Paker	372610
Curved hemostats	Fine Science Tools	13013-14
Razor blades	VWR	55411-050
100 x 20 mm cell culture dish	Corning	353003
Sterile forceps	TWD Tradewinds	DF8988-5
Sterile drapes	3M	2037
Sterile gloves	Kimberly Clark	1182307
ACK Lysis Buffer	Gibco	A1049201
100 micron mesh filter	Fisher	352360
50 mL conical tube	Fisher	1495949A