Questo protocollo descrive un metodo per la rapida trasformazione del post mortem diffuse campioni di glioma pontino intrinseca per la definizione di modelli di coltura cellulare derivati da pazienti o la caratterizzazione diretta delle cellule tumorali e microambiente.
Diffuse intrinseca Pontine glioma (DIPG) è un tumore del tronco cerebrale infantile che trasporta una prognosi universalmente fatale. Perché la resezione chirurgica non è una strategia di trattamento vitale e la biopsia non viene eseguita di routine, la disponibilità dei campioni dei pazienti per la ricerca è limitata. Di conseguenza, gli sforzi per studiare questa malattia sono state contestate da una scarsità di modelli di malattia fedeli. Per rispondere a questa esigenza, che descriviamo qui un protocollo per la rapida elaborazione dei campioni di tessuto autopsia post-mortem al fine di generare modelli di coltura cellulare derivati da pazienti resistenti che possono essere utilizzati in test in vitro o in vivo esperimenti di xenotrapianto ortotopico. Questi modelli possono essere utilizzati per lo screening per i potenziali bersagli farmacologici e di studiare i processi patobiologici fondamentali all'interno DIPG. Questo protocollo può essere ulteriormente esteso per analizzare e isolare le cellule tumorali e microambientali utilizzando cellulare fluorescenza-attivato (FACS), che consente la successiva analisi del gene expressione, espressione della proteina, o modificazioni epigenetiche del DNA presso la cella di massa o livello di singola cellula. Infine, questo protocollo può anche essere adattato per generare culture derivati da pazienti di altri tumori del sistema nervoso centrale.
DIPG è un tumore maligno del sistema nervoso centrale aggressivo che si pone nel ponte ventrale, in genere durante l'infanzia a metà 1, 2. Nonostante decenni di studi clinici, il trattamento corrente è limitata alla radioterapia, che fornisce temporaneo miglioramento o la stabilizzazione dei sintomi e si estende solo sopravvivenza mediana da una media di 3 mesi. Anche con la radioterapia, la sopravvivenza globale mediana è a soli 9 mesi con il 90% dei bambini che muoiono a causa della malattia entro 2 anni dalla diagnosi iniziale. A causa della natura infiltrante del tumore e le funzioni critiche del tronco cerebrale, la resezione chirurgica non è possibile. Inoltre, negli Stati Uniti, ottenendo biopsie chirurgiche per DIPG storicamente non è stata effettuata 3, come l'analisi istopatologica non ha alcun ruolo attuale nel guidare trattamento clinico e la diagnosi in genere può essere fatto da neuroimaging solo. Pertanto, la disponibilità di tessuto tumorale fo lo studio è limitato, limitando gli sforzi per condurre una ricerca su molecole di droga candidati e la biologia del tumore sottostante. In particolare, i miglioramenti nelle tecniche di neuroimaging e stereotassica hanno permesso lo sviluppo di biopsie sicuri di DIPG negli ultimi anni 4, che, se combinati con i progressi della biologia molecolare, hanno trasformato la nostra comprensione della malattia. Attualmente, più studi clinici utilizzando la biopsia in anticipo e profilo molecolare di DIPG per l'individualizzazione piani di trattamento sono in corso (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG e altri gliomi ad alto grado pediatrici rappresentano malattie distinte dalle loro controparti adulto glioblastoma 6, 7, e modelli sperimentali in tal modo i fedeli di DIPG sono necessari per capire la sua fisiopatologia unico e scoprire le strategie terapeutiche efficaci. Negli ultimi anni, gli sforzi per ottenere DIPG tumore t focalizzataproblema per la ricerca, al momento dell'autopsia o, meno frequentemente, la biopsia hanno rivoluzionato la nostra comprensione e capacità di studiare DIPG. Gli sforzi di sequenziamento di tutto il genoma ha rivelato una mutazione ricorrente nel H3 istone, 3A famiglia (H3F3A) e istone cluster 1, H3B (HIST1H3B), che rappresenta il primo esempio di malattia umana causata da mutazioni nel istone codifica proteine 8, 9, 10, 11 . Inoltre, un sottoinsieme di DIPGs esprime mutazioni nel gene ACVR1, che non sono stati precedentemente riportati in cancro, ma sono identiche a mutazioni trovate nel congenita infanzia dello sviluppo disturbo fibrodisplasia ossificante progressiva 8, 9, 10, 11. Come pure, le prime colture cellulari DIPG derivati da pazienti e ortotopico mo xenotrapiantodels sono state ora stabilito 1, 2, 12, 13, 14, così come modelli murini stabilite attraverso la xenotrapianto diretto delle cellule tumorali in topi immunodeficienti per generare xenotrapianti seriali 3, 14, 15. I primi sforzi di screening di droga che utilizzano questi modelli derivati da pazienti hanno identificato nuovi agenti promettenti per la traduzione clinica 4, 14 e hanno gettato le basi per almeno uno studio clinico (NCT02717455).
Questi primi passi verso il progresso sono solo l'inizio, e saranno necessari numerosi campioni di tessuto derivati da pazienti e modelli di coltura per definire sottotipi della malattia e sviluppare le strategie terapeutiche più efficaci. geneticamente motoremodelli murini strati sovrapposti di DIPG faciliteranno anche studi volti a promuovere la nostra comprensione di base della malattia. Gli sforzi fatti per generare modelli genetici per DIPG saranno aiutati dagli studi genomici fondamentali di cui sopra, ma attualmente un numero limitato di opzioni sono disponibili. Uno di questi modelli, che genera istologicamente simili alto grado gliomi del tronco encefalico, utilizza la RCA / tv-un sistema virale per guidare PDGF-B sovraespressione e la perdita Ink4a-ARF nelle cellule nestina-positivo nella fossa posteriore di topi neonati 5, 16. Un altro approccio prevede ricapitolando diversi grandi mutazioni DIPG-associato (istone H3.3 K27M mutazione, perdita di p53 e di attivazione PDGFRA) in cellule precursori neurali derivate da cellule staminali embrionali umane, che è sufficiente a rendere queste cellule tumorali 6, 7, 17. La combinazione di metodi genetici e paziente derivmodelli ED consentiranno test preclinici e favorire lo sviluppo di terapie efficaci.
Per affrontare le sfide per la ricerca DIPG sopra indicato, questo protocollo autopsia rapida è stata sviluppata per generare colture di cellule derivati da pazienti per le indagini 8, 9, 10, 11, 12, 14. Il protocollo mira a tutelare la vitalità del tessuto e massimizzare la probabilità di generare culture durevoli, nonostante le sfide connesse con lunghi intervalli post mortem e tempi di trasporto. Quando generato con successo, queste culture DIPG possono essere utilizzati in vitro manipolazioni di successive e di esperimenti in vivo xenotrapianto, consentendo la valutazione dei potenziali molecole terapeutiche sul paziente cellule derivate.
Questo protocollo descrive un metodo per il trattamento rapido di post-mortem donazioni tessuto tumorale sviluppare colture cellulari derivati da pazienti, che può essere utilizzato in una varietà di in vitro o in vivo. A causa della natura di lavorare con campioni autoptici, mantenendo campione redditività rappresenta una sfida significativa. Diversi fattori, tra cui l'intervallo post-mortem ad autopsia o il tempo richiesto per il trasporto del tessuto, dovrebbe essere minimizzato il più possibile, ma spesso sono difficili da controllare. Nella nostra esperienza, un intervallo post-mortem di meno di 6 – 8 ore (dal momento della morte al tempo che il tessuto è messo in ghiaccio il trasporto freddo e mezzi di trasporto), ha dato le migliori possibilità di stabilire una coltura cellulare durevole. E 'meglio quindi ricevere il tessuto in laboratorio entro 24 ore, e di processo per la cultura immediatamente dopo il ricevimento.
Poiché la posizione di questi casi rari varia ampiamente, ela qualità della fase di recupero tessuto influenza fortemente le possibilità di successo, la logistica di eseguire l'autopsia può essere difficile. In molti casi, al fine di ottenere i tempi di 6-8 ore, non è possibile condurre la raccolta dei tessuti in un centro accademico. Invece, avere un servizio di recupero dei tessuti su chiamata per recuperare il tessuto tumorale alla camera ardente in un protocollo IRB approvato è spesso più conveniente per il recupero dei tessuti. Ottenere il consenso informato in anticipo della morte è raccomandato e facilita la pianificazione logistica. Si raccomanda vivamente la preparazione di kit autopsia indipendenti con istruzioni chiare e approfondite e forniture sterili per tessuti di recupero (guanti, tende, bisturi). Inoltre, stabilire punti di vantaggio della comunicazione tra l'investigatore, patologo, e pompe funebri è critica. Ad esempio, il ricercatore deve discutere il protocollo con il patologo prima l'autopsia ed evidenziare gli errori più comuni. Questi errori comprendono microcontaminazione BIAL (di solito lievito) durante il recupero dei tessuti, il mancato nave attraverso il trasporto e la mancata spedizione del campione sul sufficienti ghiaccio umido in un contenitore thermoinsulated notte / accelerato. Infine, si consiglia di utilizzare un servizio di corriere porta a porta per la spedizione dei campioni per ridurre al minimo i tempi di trasporto.
Si deve anche essere presa durante la dissociazione dei tessuti per preservare la vitalità cellulare. Per esempio, l'uso dei mezzi di comunicazione progettata per preservare la salute del tessuto neurale per il trasporto (Hibernate-A integrato con antibiotico / antimicotico) aumenterà la probabilità di generare una cultura di successo. E 'anche importante mantenere il campione ad una temperatura fredda per tutto il protocollo trasferendo sempre i campioni in ghiaccio. Raccolta entrambe le frazioni di dissociazione meccanica ed enzimatici insieme a minimizzare triturazione può migliorare il successo del protocollo, in quanto entrambi i passaggi sono traumatico per le cellule. Nella nostra esperienza, mentre la maggior parte delle culture di successo nascono da entrambe le frazioni, Abbiamo avuto casi in cui uno solo dei due preparazioni stabilita una cultura durevole, potenzialmente riflette la natura delicata di questi campioni. Un altro passo traumatico nel protocollo è triturazione; una strategia che può ridurre il grado di triturazione necessaria a garantire i campioni siano completamente macinate proprio all'inizio della preparazione. Altri esempi di aspetti del protocollo progettato per migliorare la redditività del campione includono tamponi aggiunta (ad esempio, HEPES) in tutto il protocollo, che è particolarmente critico durante la dissociazione enzimatica.
Una possibile variante di questo protocollo per aumentare ulteriormente la vitalità cellulare è la rimozione del sangue rosso fase di lisi cellulare ACK. Tuttavia, in questo caso, è spesso allora necessario eseguire un passaggio ACK lisi durante la prima settimana di coltura per rimuovere le cellule rosse del sangue. Un altro aspetto di questo protocollo che può essere modificato è l'eliminazione della mielina e detriti cellulari utilizzando una densit di saccarosioy gradiente. Specificamente, altre strategie che sono stati segnalati per migliorare la vitalità cellulare delle cellule microgliali sono possibili anche in questo passaggio, come una discontinua Percoll gradiente di densità 18 o magnetici perline rimozione mielina.
Infine, la durata tra dissociazione tissutale iniziale e la comparsa di neurosfere varia tra i campioni e può richiedere da una settimana ad un mese o più. Dal momento che le culture iniziali di solito contengono un grado significativo di cellule morte e detriti cellulari, può essere difficile determinare se le cellule vitali rimangono; la coltura deve essere mantenuta per almeno 4 – 8 settimane (Figura 2). Una strategia per isolare cellule in crescita dai detriti rimanere qui viene presentato (cioè invertire filtrare gruppi di cellule e ri-placcatura in mezzi freschi). La decisione sull'opportunità di continuare a mantenere una cultura è in definitiva una decisione caso per caso, sulla base di fattori ° circostantie autopsia (ad esempio, un intervallo post-mortem prolungata, i problemi durante il trasporto dei tessuti), la dissociazione dei tessuti (ad esempio, il sangue eccessivo o detriti), e come il campione appare nella cultura. Una volta che una cultura è stabilito, l'identità deve essere convalidato dal DNA fingerprinting utilizzando analisi tandem repeat breve o un metodo simile, confrontando la coltura ad un campione del tumore originale conservati per questo scopo. Si consiglia di routine la convalida culture DNA fingerprinting per garantire che sia avvenuta nessuna contaminazione da altre culture, ad esempio ogni 3 – 6 mesi.
La generazione di queste culture DIPG derivati da pazienti rappresenta un passo importante nello sviluppo di successo delle terapie efficaci. L'espansione dei modelli derivati da pazienti culture DIPG e xenotrapianto disposizione sarà fondamentale per individuare le strategie terapeutiche più efficaci e, infine, superare questa malattia devastante.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano il sostegno della Fondazione Claire McKenna, Istituto Nazionale di Malattie Neurologiche e Stroke (NINDS K08NS070926 e R01NS092597), Dipartimento della Difesa (NF140075), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM RB4-06093 e RN3-06510), Limonata di Alex stand Foundation, The Cure Starts Now Foundation e DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Fondazione, Unravel Pediatric Cancer, Infanzia Brain Tumor Foundation, Matthew Larson Foundation, V Foundation, Fondo Famiglia Goffredo in memoria di Fiona Penelope, la DIPG Fondazione Wayland Villars, il Dylan Jewett , Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, e Jennifer Kranz Memorial fondi, N8 Foundation, Virginia e Fondo Ludwig DK per la ricerca sul Cancro, Bambino Health Research Institute presso la Stanford Anne T. e Robert M. Bass Dotati Facoltà Borsa di studio in Pediatric cancro e malattie del sangue.
Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
HBSS | Corning | 21-022-CV | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
GlutaMAX-I (100X) | Gibco | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco | 11140-050 | |
Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Razor blades | VWR | 55411-050 | |
100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
Sterile drapes | 3M | 2037 | |
Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |