Denne publikation præsenterer en protokol, der viser hvordan man måler aktiviteten af rekombinante protein fosfatase 2A katalytisk subunit (PP2Ac) som reaktion på rekombinant α-synuclein, β-synuclein eller γ-synuclein proteiner ved hjælp af en simpel kolorimetriske assay. Vi viser undersøgelsesresultater vedrørende α-synuclein specificitet mod PP2Ac i mus hjerne.
Α-Synuclein (eddike), β-Synuclein (bSyn) og γ-Synuclein (gSyn) er en bevaret familiemedlemmer af anstandsdame-lignende proteiner, der er stærkt udtrykt i hvirveldyr neuronal væv. Af de tre synucleins, har kun eddike været stærkt involveret i neurodegenerative sygdomme som Parkinsons sygdom, demens med Lewy organer, og flere System atrofi. I at studere normal eddike funktion, viser data, at eddike stimulerer aktiviteten af den katalytiske underenhed af en overflod udtrykt dephosphorylating enzym, PP2Ac in vitro og i vivo. Forudgående data viser, at eddike sammenlægning i menneskelige hjerne reducerer PP2Ac aktivitet i regioner med Lewy body patologi, hvor opløselige eddike er blevet uopløselige. Men, fordi alle tre synucleins er betydelig homologi i aminosyre-sekvenser, eksperimenter var designet til at teste, hvis alle kan modulere PP2Ac aktivitet. Ved hjælp af rekombinante synucleins og rekombinante PP2Ac protein, blev aktivitet vurderet af Malakit grønt kolorimetriske assay. Data viste, at alle tre rekombinante synucleins stimuleret PP2Ac aktivitet i celle-fri assays, at øge muligheden for, at de bevarede homologi mellem synucleins kan udstyrer alle tre homologs med evnen til at binde sig til og aktivere PP2Ac. Co-immunoprecipitation data, dog, tyder på at PP2Ac graduering sandsynligt opstår gennem endogene interaktioner mellem eddike og PP2Ac i vivo.
Undersøgelser fastlægge fordelingen af synucleins i hjernen og rygmarven vis at alle tre synucleins er beriget med neurale væv, selv om varierende mønstre af lokalisering har været rapporteret1. For eksempel eddike er mest rigelige på præsynaptiske websteder i hjernebarken og basale ganglier2,3, bSyn har en mere ensartet fordeling i hjernen og rygmarven4,5, og gSyn er mere rigelige i rygmarven og perifere ganglier6. Selv om nogle embryonale udtryk for alle synucleins kan forekomme, blive de tre homologs mere rigelige i det neonatale periode4,5,6,7,8. Bemærkelsesværdigt, data fra synuclein tredobbelt knockout mus, tyder på, at tabet af alle tre synucleins forårsager alder debut neuronal dysfunktion9, støtte vigtige synuclein funktioner i centralnervesystemet (CNS)10, 11. det er endnu ikke kendt hvis synuclein tredobbelt knockout mus Vis ændringer i PP2Ac distribution eller aktivitet. Data fra enkelt synuclein knockout mus afslører, at tab af eddike alene er i stand til at reducere PP2Ac aktivitet i hjernen12. Ud over CNS lokalisere alle synucleins til andre væv overalt i kroppen13,14,15.
På grund af sin veletablerede genetiske links til neurodegeneration16,17, er eddike blandt bedste undersøgt af de tre synucleins. Perez laboratorium har længe arbejdet på at definere normal funktionel aktiviteter af eddike, især i CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 og mere for nylig i perifere væv24,25. Blandt disse var opdagelsen at eddike spiller en vigtig lovgivningsmæssig rolle i stimulerende PP2Ac aktivitet19. PP2A aktivitet bidrager meget til normal hjernefunktion, herunder til regulering af dopamin produktion26. PP2A holoenzym består af tre uafhængige underenheder, katalytisk C subunit, PP2Ac, et stillads A subunit og én af flere forskellige lovgivningsmæssige/målretning B underenheder, der hjælpe med at lokalisere PP2A til specifikke subcellulært microdomains, hvorved PP2A funktionel diversitet27. Beviser viser, at eddike interaktioner med PP2Ac bidrage betydeligt til sin fosfatase aktivitet in vitro- og i vivo12,19,21,23, 25. Når eddike ophobes i protein aggregater, som når Lewy organer form inde neuroner for Parkinsons og demens med Lewy organer (DLB), væv med aggregerede eddike har formindsket PP2Ac aktivitet23,25, når niveauer af opløselige eddike mindskes. Eftersom at alle tre synucleins er betydelig homologi28 (eddike deler 66% identitet med bSyn og 56% med gSyn) og at eddike bidrager til aktivering af PP2Ac, det var den hypotese, at alle medlemmer af familien synuclein protein kan være i stand til at øge PP2Ac aktivitet, i det mindste i vitro. For at vurdere dette, blev PP2Ac aktivitet målt i svar til rekombinant eddike, bSyn og gSyn ved hjælp af en simpel kolorimetriske assay, modelleret efter metoden af Fathi et al. 29. denne metode og de nye resultater er beskrevet heri.
Denne Malakit grønt assay med pT blev brugt til at måle PP2Ac aktiviteten, fordi det er lettere at udføre end den klassiske metode, der bruger 32P-mærket substrater. En anden fordel ved denne analyse over radioaktive assays er at radioisotoper udgøre nogle risiko og kan være dyrt, især 32P-mærkede molekyler, der har korte halveringstider, som begrænser antallet af assays man kan udføre før reagenser udløber. Bruge Malakit grønt i stedet for radioaktivitet også eliminerer behovet for at bortskaffe 32affald P. Malakit grønt assays er også ganske følsomme, når du måler aktiviteten af Serin/Threonin fosfataser sammenlignet med en anden kolorimetriske assay, der bruger substrat p-nitrophenylphosphate (pNPP), hvilket er non-selektive, da det kan være defosforyleret af en bred række enzymer32.
Kommercielle Malakit grønt kits til at måle PP2A aktiviteten har været tilgængelige i nogen tid, og blev tidligere anvendt i laboratoriet. Men når du laver mange Malakit grønt assays, sådanne kits blev uoverkommeligt dyre. Derudover kommercielle kits for PP2A aktivitet er stabile kun for ét år, mens at have reagenser findes i pulveriseret form og med korrekt opbevaring, give let tilgængelige assay komponenter, der er strukturelt stabil i lange perioder.
Før testning bSyn og gSyn, blev eddike anvendt som positiv kontrol at stimulere PP2Ac aktivitet og til at bestemme mængden af PP2Ac kræves for assays og også bekræfte, at resulterende data forbliver på skalaen med standardkurven (150-2400 pmol PO4 ). Det er bemærkelsesværdigt, at hvis eddike stimulerer PP2Ac kraftigt, selv om reaktionen er typisk lineær, data vil gå off skala og kemikalier i MGT løsning bundfald, hvilket gør det umuligt at måle præcise mængder af frigivet gratis PO4 med en plade læser.
Da eddike bidrager til PP2Ac aktivitet in vivo og in vitro-12,19,21,23,25, og at alle synucleins har betydelig homologi, det havde været den hypotese, at alle synuclein familiemedlemmer kan være i stand til at stimulere PP2Ac i celle gratis assays. Bruger de kolorimetriske assay beskrevet her, blev det konstateret, at faktisk alle tre rekombinante synucleins (eddike, bSyn, gSyn) stimuleret PP2Ac aktivitet, at øge muligheden for, at alle tre synucleins kan udføre lignende funktioner i nervesystemet. Men hjernen fra Parkinsons eller demens med Lewy Body tilfælde har mindre PP2Ac aktivitet i væv, som indeholder meget aggregerede eddike23. Musen væv husly Lewy body-lignende patologi også udviser reduceret PP2Ac aktivitet25. Dette, og nye data i figur 3 og forudgående data fra eddike knockout mus12, tyder stærkt på at hverken bSyn eller gSyn typisk kan kompensere for tabet af opløselige eddike i hjernen, eller alternativt at disse synuclein homologs kan ikke forbinde med PP2Ac så stærkt som eddike som vist (figur 3). Allen hjernen Atlas viser colocalization af alle tre synuclein mRNAs i mange områder i hjernen, og selv om tredobbelt synuclein knockout mus har været genererede9,33, PP2Ac aktivitet ikke er blevet vurderet i denne model. Interessant, eddike, det er fosforyleret på Ser129 af Polo-lignende kinase 2, er mindre i stand til at aktivere PP2Ac12, men beviser vist her for bSyn tyder på, at bSyn fosforylering er usandsynligt at påvirke PP2Ac aktivitet, som meget lidt bSyn kom ned med PP2Ac i mus hjernen (figur 3). Tilsammen, tyder dataene på, at endogene PP2Ac aktivitet modulatorer, som eddike, sandsynligt, bidrager til wellness og sygdom.
Den protokol, der er skitseret her er en simpel endnu kraftfulde teknik til bestemmelse af PP2Ac til dephosphorylate phosphopeptide substrat som svar på forskellige behandlinger. Eksempelvis kan denne samme metode bruges til at teste andre PP2Ac aktivatorer, såsom ceramider samt potentielle nye therapeutics34, eller at vurdere virkningen af PP2Ac hæmmere i vitro. Det er også vigtigt at påpege, at lignende assays kan måler aktiviteten af PP2Ac, der har været isoleret i 1 d 6 immunoprecipitation fra celle ekstrakter eller kroppens væv, som tidligere beskrevet af forfatterne12,19, 25. fremtidige ansøgninger om Malakit grønt analysen findes ud over måling PP2Ac aktivitet, som ATP aktivitet kan også bestemmes ved hjælp af sådan en analyse.
Bemærk, at en standardkurve skal genereres hver gang for hver uafhængig PP2Ac assay. Det er obligatorisk for at sikre, at alle reagenser er fosfat gratis, som gratis fosfater kunstigt øge baggrunden signal og give fejlagtige resultater. På dagen for analysen er det vigtigt at forberede nok friske MGT løsning for alle prøver der skal analyseres. MGT er også kun godt den dag, hvor det er lavet og tendens til at bundfald efter et par timer. PP2Ac købt fra en kreditor skal være aliquotted og opbevares frosset snart efter at den er modtaget for at forhindre fryse tø cykler, der reducerer dets aktivitet. Som andre fosfataser kan dephosphorylate pT substrat (fx PP1 og FP535), når du analyserer celle- eller vævsdel ekstrakter, hvor PP2Ac ikke er udskilt af immunoprecipitation, prøver skal være bestået over kolonner til at fjerne frie fosfater og specifikke hæmmere af fosfataser skal bruges til at bekræfte fosfatase specificitet, som tidligere beskrevet18.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne værdsætter indsats af forudgående laboratorium medlemmer Kendra Mackett, Sandra Slusher og Jie Chen, der arbejdede for at optimere metoden. Forfatterne også takke National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso videnskabelig aktivitet forskning projekt (SARP), Lizanell og Colbert Coldwell Foundation, flere System atrofi koalition, Hoy familie forskning, og Anna Mae Doyle gave midler til finansiel støtte af denne forskning.
Reagent | |||
1 M Trizma Base | Sigma-Aldrich | T15003 | |
CaCl2 (calcium chloride) | Fisher Scientific | C70-500 | |
Concentrated HCl | JT Baker | 9535-33 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
Malachite green oxalate salt | Sigma-Aldrich | M6880 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) | New England peptide LLC | BP12-011 | |
KH2PO4 (potassium phosphate) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
Recombinant human PP2A C subunit | Cayman Chemical | 10011237 | |
Recombinant human α-synuclein | rPeptide | S-1001-2 | |
Recombinant human β-synuclein | rPeptide | S-1003-2 | |
Recombinant human γ-synuclein | rPeptide | S-1007-2 | |
PP2Ac 1D6 antibody | Millipore | 05-421 | |
PP2Ac antibody 1D6 | Novus Biologicals | NB100-92217 | |
aSyn antibody C-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
bSyn antibody EP1537Y | Novus Biologicals | NB100-79903 | |
gSyn antibody E-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10698 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo-Fisher Scientific | 89882 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment/Software | |||
Multiskan Spectrum Plate Reader | Thermo Fisher Scientific | 51118650 | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | ||
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AB15P |