Cette publication présente un protocole indiquant comment mesurer l’activité de la sous-unité catalytique de la 2 a phosphatase protéine recombinante (PP2Ac) en réponse à recombinant synucléine α, β-synucléine ou γ-synucléine protéines à l’aide d’un simple Dosage colorimétrique. Nous montrons des constatations relatives à la spécificité de la synucléine α vers PP2Ac dans le cerveau de souris.
Α-synucléine (asynchrone), β-synucléine (bSyn) et γ-synucléine (gSyn) sont membres d’une famille conservée des protéines semblables à ceux chaperon qui sont fortement exprimée dans les tissus neuronaux vertébrés. De le trois synucleins, seulement asynchrone a été fortement impliqué dans les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson, la démence à corps de Lewy et atrophie. En étudiant la fonction asynchrone normale, les données indiquent qu’asynchrone stimule l’activité de la sous-unité catalytique de l’enzyme de dephosphorylating abondamment exprimée, PP2Ac in vitro et in vivo. Données préalables montrent que l’agrégation asynchrone dans le cerveau humain réduit PP2Ac l’activité dans les régions où la pathologie de corps de Lewy, où soluble asynchrone est devenu insoluble. Cependant, parce que tous les trois synucleins ont une forte homologie avec les séquences d’acides aminés, les expériences ont été conçues pour tester si tous peuvent moduler l’activité PP2Ac. En utilisant synucleins recombinante et protéine recombinante de PP2Ac, l’activité a été évaluée par dosage colorimétrique de vert de malachite. Les données ont révélé que tous les trois synucleins recombinants stimulée PP2Ac l’activité dans les essais acellulaire, évoquant la possibilité que l’homologie conservée entre synucleins peut doter tous les trois homologues avec la capacité de lier et activer le PP2Ac. Co-Immunoprécipitation, cependant, suggèrent que PP2Ac modulation susceptible se produit grâce à des interactions endogènes entre asynchrone et PP2Ac in vivo.
Études de définition de la distribution des synucleins dans le cerveau et la moelle épinière Voir la que tous les trois synucleins sont enrichis dans les tissus nerveux, bien que divers modèles de localisation ont été signalés1. Par exemple, asynchrone est la plus abondante sur les sites présynaptiques dans le cortex cérébral et des ganglions de la base de2,3, bSyn a une distribution plus uniforme dans le cerveau et la moelle épinière4,5, et gSyn est plus abondant dans la moelle épinière et les ganglions périphériques6. Bien que certaines expression embryonnaire de tous les synucleins peut-être se produire, les trois homologues deviennent plus abondantes au cours de la période néonatale4,5,,6,7,8. Remarquablement, données de souris synucléine triple, indiquer que la perte de tous les trois synucleins provoque âge apparition dysfonction neuronale9, soutenir les fonctions de la synucléine important dans le système nerveux central (SNC)10, 11. on ne sait pas encore si la synucléine triple souris montrent des changements dans la distribution PP2Ac ou activité. Données de souris knock-out synucléine unique révèlent que la perte du seul asynchrone est capable de réduire de façon significative l’activité PP2Ac dans le cerveau de12. En plus de la CNS, synucleins tous les localiser dans d’autres tissus dans le corps de14,13,15.
En raison de ses liens génétiques bien établie à neurodégénérescence16,17, asynchrone est parmi les meilleurs étudié des trois synucleins. Le laboratoire de Perez a travaillé longtemps pour définir les activités fonctionnelles normales d’asynchrone, en particulier dans le CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 et plus récemment dans les tissus périphériques24,25. Parmi ces derniers, a été la découverte qu’asynchrone joue un rôle réglementaire en stimulant de l’activité de PP2Ac19. PP2A activité contribue largement au fonctionnement normal du cerveau, y compris pour la régulation de la production de dopamine26. L’holoenzyme PP2A est constituée de trois sous-unités indépendantes, la sous-unité catalytique de la C, PP2Ac, une sous-unité d’échafaudage A et celle de plusieurs différentes réglementation/ciblage sous-unités B qui aident à localiser PP2A à spécifiques microdomaines subcellulaires, fournissant ainsi PP2A la diversité fonctionnelle27. Éléments de preuve montrent que les interactions asynchrone avec PP2Ac contribuent significativement à la phosphatase activité in vitro et in vivo12,19,21,23, 25. Lorsque asynchrone s’accumule dans les agrégats de protéines, comme il le fait quand Lewy corps forme à l’intérieur des neurones de la maladie de Parkinson et de démence à corps de Lewy (DLB), tissus avec asynchrone agrégé ont diminué de PP2Ac activité23,25, lorsque niveaux d’asynchrone soluble diminuent. Étant donné que tous les trois synucleins ont une importante homologie28 (asynchrone partage 66 % d’identité avec bSyn et 56 % avec gSyn) et celui asynchrone contribue à l’activation de PP2Ac, il a émis l’hypothèse que tous les membres de la famille des protéines synucléine peuvent être en mesure de augmenter l’activité PP2Ac, au moins in vitro. Pour déterminer cela, a mesuré l’activité de PP2Ac en réponse à recombinant asynchrone, bSyn et gSyn à l’aide d’un simple Dosage colorimétrique, modelé d’après la méthode de Fathi al 29. cette méthode et les nouveaux résultats sont décrits dans les présentes.
Ce test de vert malachite avec pT a été utilisé pour mesurer l’activité de PP2Ac parce qu’il est plus facile à réaliser que la méthode classique, qui utilise des substrats marqués P 32. Un autre avantage de ce test sur des essais radioactifs est que radio-isotopes présentent certains risques et peuvent être coûteux, surtout 32de molécules marquées P qui ai courte demi-vie, qui limite le nombre d’essais, on peut effectuer avant réactifs n’expirent. À l’aide de vert de malachite, plutôt que la radioactivité élimine également le besoin de disposer de 32P déchets. Tests de vert de malachite sont également très sensibles lors de la mesure de l’activité des sérine/thréonine phosphatases par rapport à un autre Dosage colorimétrique qui utilise le substrat p-nitrophénylphosphate (pNPP), qui est non sélectif car il peut être déphosphorylé par un grand nombre d’enzymes32.
Kits de vert de malachite commercial pour mesurer l’activité PP2A existent depuis longtemps et ont déjà été utilisées dans le laboratoire. Toutefois, lorsque vous effectuez plusieurs essais de vert de malachite, ces trousses est devenu prohibitifs. En outre, des kits commerciaux pour activité PP2A sont stables seulement pendant un an, tout en ayant des réactifs disponibles en poudre forme et avec bon rangement, fournissent des éléments d’analyse disponibles qui sont structurellement stables pendant de longues périodes de temps.
Avant de tester bSyn et gSyn, asynchrone a été utilisé comme témoin positif pour stimuler l’activité PP2Ac et pour déterminer la quantité de PP2Ac requis pour les tests et aussi pour confirmer que les données qui en résulte restent sur l’échelle de la courbe d’étalonnage (150-2400 pmol de PO4 ). Il est à noter que si asynchrone stimule PP2Ac trop fortement, si la réaction est généralement linéaire, données seront éteint échelle et produits chimiques dans la solution MGT précipitent, rendant impossible de mesurer les quantités exactes sorti libre-PO4 avec une plaque lecteur.
Étant donné qu’asynchrone contribue à PP2Ac activité in vivo et in vitro12,19,21,,du23au25et que tous les synucleins ont une forte homologie avec, il avait été l’hypothèse que tous les membres de la famille synucléine sont susceptibles de stimuler PP2Ac en essais libres sur des cellules. En utilisant le dosage colorimétrique décrit ici, on a constaté qu’en effet, tous les trois synucleins recombinantes (asynchrone, bSyn, gSyn) stimulée PP2Ac activité, ce qui soulève la possibilité que tous les trois synucleins peut exercer des fonctions similaires dans le système nerveux. Cependant, le cerveau de la maladie de Parkinson ou la démence à corps de Lewy cas ont moins d’activité PP2Ac dans les tissus contenant hautement agrégées asynchrone23. Tissus de souris nourrissait Lewy présentent aussi des corps-comme pathologie réduit PP2Ac activité25. Cela, et les nouvelles données à la Figure 3 , ainsi que des données préalables du asynchrone knockout souris12, suggèrent fortement que ni bSyn ni gSyn peut généralement compenser la perte d’asynchrone soluble dans le cerveau, ou, subsidiairement, que ces homologues synucléine ne peuvent pas associer à PP2Ac aussi forte qu’asynchrone comme illustré (Figure 3). L’Atlas du cerveau Allen montre co-localisation des tous les trois synucléine ARNm dans plusieurs régions du cerveau, et bien que les souris knock-out synucléine triple ont été généré9,33, PP2Ac activité n’a pas été évaluée dans ce modèle. Fait intéressant, asynchrone qui est phosphorylé sur Ser129 par Polo-like kinase 2, est moins en mesure d’activer PP2Ac12, mais montré ici pour bSyn suggèrent que la phosphorylation de bSyn est peu probable à l’impact de l’activité PP2Ac, car très peu bSyn est descendu avec PP2Ac dans le cerveau de souris (Figure 3). Pris ensemble, les données suggèrent que PP2Ac endogènes modulateurs de l’activité, comme asynchrone, susceptibles de contribuent au bien-être et à la maladie.
Le protocole décrit ici est une technique simple mais puissante pour déterminer la capacité des PP2Ac à déphosphorylent un substrat phosphopeptide en réponse à divers traitements. Par exemple, cette même méthode peut être utilisée pour tester les autres activateurs de PP2Ac, tels que les céramides ainsi que de nouveaux traitements potentiels34, ou pour évaluer l’impact des inhibiteurs de la PP2Ac in vitro. Il est également important de souligner que des tests similaires peuvent mesurer l’activité de PP2Ac qui a été isolé par 1 6 immunoprécipitation des extraits de cellules ou de tissus de l’organisme, tel que déjà décrits par les auteurs12,19, 25. avenir applications pour le dosage de vert de malachite existent au-delà de mesure de l’activité PP2Ac, comme l’activité ATP peut aussi être déterminée à l’aide d’un tel test.
Remarque, une courbe d’étalonnage doit être générée à chaque fois pour chaque dosage PP2Ac indépendant. Il est obligatoire de s’assurer que tous les réactifs utilisés sont phosphate libre, comme les phosphates gratuits artificiellement augmentent le signal de fond et produisent des résultats erronés. Le jour du test, il est essentiel de préparer la solution MGT assez frais pour tous les échantillons à doser. En outre, MGT est seulement bon le jour où il est fait et a tendance à précipiter après quelques heures. PP2Ac acheté auprès d’un fournisseur doit être aliquoté et stockés congelés peu de temps après sa réception pour empêcher le gel-dégel qui réduisent son activité. Comme autres phosphatases peuvent déphosphorylent le substrat pT (p. ex. PP1 et PP535), lors de l’analyse des extraits cellulaires ou tissulaires dans lequel PP2Ac n’a pas été isolé par immunoprécipitation, les échantillons doivent être passés sur colonnes pour éliminer les phosphates gratuits et des inhibiteurs spécifiques des phosphatases doivent être utilisés pour confirmer la spécificité de la phosphatase, comme précédemment décrit18.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs reconnaissants des efforts déployés par les membres du laboratoire préalables Kendra Mackett, Sandra Slusher et Jie Chen, qui a travaillé à optimiser la méthode. Les auteurs remercient également le National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso savante activité recherche projet (SARP), Lizanell et Colbert Coldwell Foundation, plusieurs système atrophie Coalition, Recherche famille Hoy et Anna Mae Doyle cadeau fonds de soutien financier de cette recherche.
Reagent | |||
1 M Trizma Base | Sigma-Aldrich | T15003 | |
CaCl2 (calcium chloride) | Fisher Scientific | C70-500 | |
Concentrated HCl | JT Baker | 9535-33 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
Malachite green oxalate salt | Sigma-Aldrich | M6880 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) | New England peptide LLC | BP12-011 | |
KH2PO4 (potassium phosphate) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
Recombinant human PP2A C subunit | Cayman Chemical | 10011237 | |
Recombinant human α-synuclein | rPeptide | S-1001-2 | |
Recombinant human β-synuclein | rPeptide | S-1003-2 | |
Recombinant human γ-synuclein | rPeptide | S-1007-2 | |
PP2Ac 1D6 antibody | Millipore | 05-421 | |
PP2Ac antibody 1D6 | Novus Biologicals | NB100-92217 | |
aSyn antibody C-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
bSyn antibody EP1537Y | Novus Biologicals | NB100-79903 | |
gSyn antibody E-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10698 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo-Fisher Scientific | 89882 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment/Software | |||
Multiskan Spectrum Plate Reader | Thermo Fisher Scientific | 51118650 | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | ||
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AB15P |