このパブリケーションは、組換え α-シヌクレイン、β シヌクレイン、または単純な比色試金を使用して γ シヌクレイン蛋白質への応答で組換えタンパク質脱燐酸化酵素 2 a 触媒サブユニット (PP2Ac) の活性を測定する方法を示すプロトコルを示します。マウス脳における PP2Ac に対する α-シヌクレイン特異性に関する知見を紹介します。
Α-シヌクレイン (非同期) と β シヌクレイン (bSyn)、γ シヌクレイン (gSyn) は、脊椎動物の神経組織で高発現しているシャペロンのような蛋白質の保存ファミリーのメンバーです。3 つの synucleins の非同期のみは、パーキンソン病、多系統萎縮症とレビー小体認知症などの神経変性疾患に強く関与しています。通常非同期関数を勉強のデータを示す、非同期、豊かに表現された dephosphorylating の酵素、PP2Ac in vitroとin vivoの触媒サブユニットの活性を刺激します。前のデータは、人間の脳で非同期集約が、可溶性非同期が不溶性になるレビー小体型体病理学がある地域で PP2Ac 活動を減少させることを示します。ただし、すべての 3 synucleins がアミノ酸配列の相同性をかなりあるため実験は PP2Ac の活動を調節することができますすべての場合をテストするため設計されました。組換え synucleins と PP2Ac の組換え蛋白質を使用して、アクティビティをマラカイト グリーンの比色定量法によって評価しました。データは、すべて 3 組換え synucleins が PP2Ac synucleins で保存された相同性可能性がありますにバインドし、PP2Ac を有効にする能力を持つすべての 3 つの同族体を授けること可能性を高める細胞試金活動を刺激することを明らかにしました。Co 免疫沈降データはただし、非同期と生体内でPP2Ac の内因性相互作用を通じて PP2Ac 変調の可能性がありますが発生することをお勧めします。
ローカリゼーションの変動パターンが脳・神経組織ですべての 3 synucleins が濃縮され、脊髄を synucleins の分布を定義する研究報告1です。たとえば、非同期は、大脳皮質と大脳基底核2,3シナプス前サイトの最も豊富な bSyn は、脳と脊髄の4、5より均一な分布と gSyn 脊髄で豊富であります。および末梢神経節6。すべての synucleins のいくつかの胚の式可能性があります発生しませんが、3 つの同族体は、新生児期4,5,6,7、8時に豊かになります。驚くことに、シヌクレイン トリプル ノックアウト マウスからのデータを示す年齢発症神経機能障害9、中枢神経系 (CNS)10,重要なシヌクレイン機能をサポートをすべての 3 つの synucleins の損失に原因11. シヌクレイン トリプル ノックアウト マウス PP2Ac 配布または活動の変更を表示する場合それはまだ知られていません。単一シヌクレイン ノックアウト マウスからのデータでは、単独で非同期の損失は脳12の PP2Ac 活動を大幅に削減することができることを明らかにします。中枢神経系、に加えてすべての synucleins を体13,14,15で他の組織にローカライズします。
神経変性16,17に確立された遺伝リンクがその、ため非同期最高の間で検討した 3 つの synucleins の。ペレス研究室は特に中枢神経系11,12,18,の19,20,21、非同期、通常の機能的な活動を定義するくらい働いてください。 22,23と最近では末梢組織24,25。これらのうち、その非同期を発見された刺激的な PP2Ac 活動19の主要規制の役割を果たしています。PP2A 活動はドーパミン生産26の規制では、正常な脳機能に広く貢献します。3 つの独立した亜単位、触媒 C サブユニット、PP2Ac、足場 A サブユニットといくつか異なる規制/ターゲット B サブユニットの特定細胞内のミクロ相分離構造を PP2A を提供する PP2A をローカライズするために、1 つから成っている PP2A ホロ酵素機能的多様性27。証拠は、PP2Ac との非同期対話がホスファターゼ活性の in vitroとin vivo12,19,21,23に大きく貢献することを示しています。 25。非同期は、レビー小体型はレビー小体 (DLB) を伴うパーキンソン病や認知症の神経細胞内のフォームを体の場合とタンパク質凝集体に蓄積、組織集約された非同期 PP2Ac 活動23,25を減少しているときは、水溶性の非同期のレベルを減少させます。すべての 3 つの synucleins を持つ重要な相同性28 (非同期は、bSyn と gSyn 56% と 66% の相同を共有) とその非同期 PP2Ac の活性化に貢献する、仮説シヌクレイン蛋白ファミリーのすべてのメンバーがすることができます少なくとも PP2Ac 活動を高める体外。Fathiら法をモデルにした簡易比色定量法を用いた gSyn、bSyn、組換え非同期応答するために、PP2Ac 活動を測定しました。29します。 このメソッドは、新しい調査結果はここに詳細な。
Pt このマラカイト グリーン分析は、 32P 標識基板を使用する古典的な方法よりも簡単だから、PP2Ac 活性を測定に使用されました。放射性試金にこの試金のもう一つの利点は、放射性同位元素はいくつかの危険性と高価なことができます、特に32P 標識分子を短い半減期、試金の試薬の有効期限が切れる前に 1 つ実行することができます数を制限します。P 無駄にマラカイト グリーンを使用してなく、放射能も32の処分する必要があります。マラカイト グリーンの試金は、可能な限り非選択的である基板 p-nitrophenylphosphate (同時) を使用して別の比色定量法と比較した場合にセリン/スレオニン脱燐酸化酵素の活性の測定時にも非常に敏感酵素32の広い数によって脱燐酸化。
商業マラカイト グリーン PP2A 活性を測定するキットはいくつかの時間のために利用されているし、研究室で以前使用されました。しかし、多くのマラカイト グリーン分析の際に、このようなキットなった非常に高価。さらに、PP2A 活動の商業キット フォームを粉末試薬で利用可能なを持っていることが、わずか 1 年の安定と適切なストレージ提供時間の長い期間は構造的に安定した、容易に利用可能な分析コンポーネント。
PP2Ac 活動を刺激して、アッセイに必要な PP2Ac の量を決定してまた標準曲線 (PO4の 150 2400 pmol のスケール上に結果のデータが残ることを確認するは、非同期を肯定的な制御として使用 bSyn と gSyn をテストする前に).それが注目される非同期 PP2Ac を刺激する場合余りに強く、反応は通常線形スケール データが消えるし、化学物質管理ソリューションを沈殿させる、リリースされた無料 PO4プレートの正確な量を測定することは不可能リーダー。
非同期が貢献することを考える PP2Ac 活動の生体内および生体外で12,19,21,23,25とすべての synucleins かなり相同性がある、それはされていたシヌクレイン家族全員が携帯無料試金で PP2Ac を刺激することができますと仮定しました。ここで説明されている比色試金を使用して、それが刺激すべての 3 synucleins が神経系と同様の機能を実行可能性があります可能性を高める PP2Ac 活動を確かに、3 つすべての組換え synucleins (非同期、bSyn、gSyn) が見つかりました。しかし、パーキンソン病から脳や認知の場合は、高度を含む組織の少ない PP2Ac 活性を持つレビー小体症集計非同期23。Lewy ボディのような病理も展示をかくまっているマウス組織減少 PP2Ac 活動25です。これは、図 3に新しいデータだけでなく、非同期ノックアウト マウス12から前のデータも bSyn も gSyn 通常水溶性非同期の損失を補うことがでくことを強くお勧めし、脳、またはまたそれらシヌクレイン同族体はできません。PP2Ac に示されている (図 3) として非同期として強く関連付けます。アレンの頭脳地図書は、多くの脳領域ですべて 3 シヌクレイン Mrna の共存を示しがトリプル シヌクレイン ノックアウト マウスが生成された9,33, そのモデルの活動が評価されていない PP2Ac をされているにもかかわらずです。興味深いことに、ポロ様キナーゼ 2、による Ser129 のリン酸化は非同期 PP2Ac12をアクティブにすることができないが、bSyn の示す証拠提案する非常に小さな bSyn 付属として、その bSyn のリン酸化は PP2Ac の活動に影響を与える可能性があります。PP2Ac マウス脳内 (図 3)。一緒に取られて、非同期、可能性のような内因性の PP2Ac 活動変調が健康と病気に貢献することが示唆されました。
ここで説明されているプロトコルは、様々 な治療への応答でリン酸化ペプチド基質を dephosphorylate に PP2Ac の容量を決定するシンプルで強力な手法です。例えば、セラミドだけでなく、潜在的な新規治療34, などの他の PP2Ac 活性剤をテストするまたは PP2Ac 阻害剤の in vitroの影響を評価するためには、これと同じ方法を使用できます。また、似たような試金が 1 6 で絶縁しています PP2Ac の活性を測定できることを指摘することが重要だ細胞抽出液や著者の12,19,によって前述の体内組織から免疫沈降25. マラカイト グリーンの試金のための将来のアプリケーションは、このような分析を使用して、ATP 活性を決定、PP2Ac 活性の測定を超えて存在します。
標準的な曲線を生成する必要が各時間毎の独立した PP2Ac の試金のために注意してください。確実に用いられるすべての試薬リン酸無料、無料の隣酸塩は人工的にバック グラウンド信号を増加し、誤った結果を生成するために必須です。アッセイの日では、すべてのサンプルを試金する十分な新鮮な管理ソリューションを準備する重要です。また、MGT のみ良い日ですが、数時間後に沈殿する傾向があります。ベンダーから購入した PP2Ac aliquotted をする必要があります、保存活動を削減凍結融解のサイクルを防ぐために受信後すぐに冷凍します。他のホスファターゼは pT 基板 (例えばPP1 と PP535) を dephosphorylate ことができる、無料のリン酸塩を削除する列にサンプルを渡す必要があります、PP2Ac が免疫沈降で孤立していない細胞や組織の抽出物を分析する場合脱燐酸化酵素の特異的阻害剤は脱燐酸化酵素特異性、前述の18の確認に使用する必要があります。
The authors have nothing to disclose.
著者は、事前研究室メンバー メソッドを最適化するために働いていた陳杰、サンドラ Slusher、ケンドラ Mackett による努力を感謝しています。また、著者に感謝健康の国民の協会、マイケル ・ j ・ フォックス財団、テキサスの技術大学健康科学センター エル ・ パソ学術活動研究プロジェクト (SARP)、Lizanell、コルバート コールドウエル財団、複数システムの萎縮連合、ホイ家族研究と本研究の支援のためアンナ メイ ドイル ギフト資金。
Reagent | |||
1 M Trizma Base | Sigma-Aldrich | T15003 | |
CaCl2 (calcium chloride) | Fisher Scientific | C70-500 | |
Concentrated HCl | JT Baker | 9535-33 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
Malachite green oxalate salt | Sigma-Aldrich | M6880 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) | New England peptide LLC | BP12-011 | |
KH2PO4 (potassium phosphate) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
Recombinant human PP2A C subunit | Cayman Chemical | 10011237 | |
Recombinant human α-synuclein | rPeptide | S-1001-2 | |
Recombinant human β-synuclein | rPeptide | S-1003-2 | |
Recombinant human γ-synuclein | rPeptide | S-1007-2 | |
PP2Ac 1D6 antibody | Millipore | 05-421 | |
PP2Ac antibody 1D6 | Novus Biologicals | NB100-92217 | |
aSyn antibody C-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
bSyn antibody EP1537Y | Novus Biologicals | NB100-79903 | |
gSyn antibody E-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10698 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo-Fisher Scientific | 89882 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment/Software | |||
Multiskan Spectrum Plate Reader | Thermo Fisher Scientific | 51118650 | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | ||
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AB15P |