이 게시 재조합 α-synuclein, β-synuclein, 또는 간단한 색도계 분석 결과 사용 하 여 γ-synuclein 단백질 재조합 단백질 인산 가수분해 효소 2A 촉매 소 단위 (PP2Ac)의 활동을 측정 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제공 합니다. 우리는 쥐의 뇌에서 PP2Ac로 α-synuclein 특이성에 관한 연구 결과 보여줍니다.
Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn), 및 γ-Synuclein (gSyn) 높은 척추 신경 조직에 표현 되는 보호자와 같은 단백질의 보존된 가족의 구성원입니다. 3 synucleins의만 aSyn가 파 킨 슨 병, 치 매 Lewy 몸, 그리고 여러 시스템 위축 등 신경 장애에서 강하게 연루 되었습니다. 일반 aSyn 함수를 공부 하 고, 데이터를 풍부 하 게 표현된 dephosphorylating 효소 PP2Ac 체 외 , vivo에서의 촉매 소 단위의 활동을 자극 하는 그 aSyn 나타냅니다. 사전 데이터는 인간 두뇌에 있는 aSyn 집계 Lewy 몸 병 리, 수용 성 aSyn 불용 성 되고있다 영역에서 PP2Ac 활동 감소 보여준다. 그러나, 모든 3 개의 synucleins 아미노산 시퀀스에서 상당한 homology를가지고 있기 때문에 실험 모든 PP2Ac 활동을 조절할 수 있는지 테스트 하도록 설계 되었습니다. 재조합 synucleins 및 PP2Ac 재조합 형 단백질을 사용 하 여, 활동 공작 석 녹색 색도계 분석 결과 의해 평가 되었다. 데이터는 모든 3 개의 재조합 synucleins 셀 무료 분석 실험, synucleins 사이 보존된 homology 바인딩할 하는 PP2Ac 활성화 능력을 가진 모든 3 개의 homologs를 부여 수 있습니다 가능성 제기에 PP2Ac 활동 자극 밝혔다. 그러나 Co immunoprecipitation 데이터,, PP2Ac 변조 가능성이 aSyn와 PP2Ac에서 vivo에서간의 내 생 적인 상호 작용을 통해 발생 하는 것이 좋습니다.
다양 한 패턴의 지역화 되어 있지만에 뇌 척수 신경 조직, 모든 3 개의 synucleins 농축은 synucleins의 배포를 정의 하는 연구 보고1. 예를 들어, aSyn은 대뇌 피 질 및 기초 중추2,3연 접 사이트에서 가장 풍부한, bSyn는 더 균일 한 분포 두뇌와 척수4,5, 이며 gSyn 척수에 더 풍부한 그리고 주변 신경6. 모든 synucleins의 배아 식 일부 발생할 수 있습니다, 비록 3 homologs는 신생아 기간4,5,6,,78동안 더 풍부한 되. 놀랍게도, synuclein 트리플 녹아웃 쥐에서 데이터 손실의 모든 3 개의 synucleins 나이 발병 신경 부전9, 중앙 신경 시스템 (CNS)10, 에서 중요 한 synuclein 기능을 지 원하는 원인 표시 11. 그것은 아직 알려져 있지 synuclein 트리플 녹아웃 쥐 PP2Ac 배포 또는 활동에 변화를 표시 하는 경우. 단일 synuclein 녹아웃 쥐에서 데이터 공개 aSyn 혼자의 손실 뇌12에 PP2Ac 활동을 크게 줄일 수 있다. CNS, 뿐만 아니라 모든 synucleins 본문13,,1415에 걸쳐 다른 조직에 지역화합니다.
그것의 기초가 튼튼한 유전 링크를 neurodegeneration16,17, 때문에 aSyn는 최고의 공부 3 synucleins의. 페레즈 실험실 특히 CNS11,12,,1819,20,21, aSyn의 정상 기능 활동을 정의 하 긴 했습니다. 22,23 주변 조직24,25에서 최근에. 이러한 가운데, 그 aSyn 발견 했다 자극 PP2Ac 활동19에서 핵심 규제 역할을 한다. PP2A 활동 도파민 생산26의 규정을 포함 하 여 정상적인 뇌 기능에 널리 기여 한다. PP2A holoenzyme 구성 3 개의 독립적인 소 단위, 촉매 C 소 단위, PP2Ac, 스 캐 폴딩 A 소 단위, 및 여러 다른 규제/타겟팅 B 소 단위 PP2A를 제공 하는 특정 subcellular microdomains에 PP2A를 지역화 하는 데 도움이 중 하나 기능의 다양성27 증거를 보여주는 PP2Ac와 aSyn의 상호 작용의 인산 가수분해 효소 활동 생체 외에서 그리고 vivo에서12,,1921,23에 크게 기여 25. 집계 aSyn 조직 PP2Ac 활동23,25감소는 aSyn 단백질 집계, Lewy Lewy 몸 (DLB)와 파 킨 슨 병 및 치 매 신경 내부 형태의 시체 때와 마찬가지로 축적 때 때 녹는 aSyn의 수준을 감소. 모든 3 개의 synucleins는 상당한 상 동28 을 (aSyn bSyn와 gSyn 56% 66% 정체성을 공유) 및 PP2Ac의 활성화에 기여 하는 그 aSyn, synuclein 단백질 가족의 모든 구성원 수는 가설 이었다 증가 PP2Ac 활동, 적어도 생체 외에서. 이 평가, PP2Ac 활동 재조합 aSyn, bSyn, 및 gSyn Fathi 외 의 방법 후 간단한 색도계 분석 결과 사용 하 여 측정 되었다 29.이 메서드와 소설 발견 여기 상세한.
PT이 공작 석 녹색 분석 결과 32P 표시 기판 사용 하는 고전적인 방법 보다 수행 하기가 때문에 PP2Ac 활동을 측정 하기 위해 사용 되었다. 방사능 분석 실험을 통해이 분석 결과의 또 다른 장점은 radioisotopes 일부 위험을 제기 하 고 비쌀 수 있다, 특히 32P 이라는 분자를가지고 짧은 반감기, 분석 실험 시 약 만료 전에 수행할 수 있는 한의 수를 제한 하는. 방사능도 하지 않아도 32의 처리 보다는 공작 석 녹색을 사용 하 여 P 낭비. 공작 석 녹색 분석은 또한 매우 민감한 기판 p-nitrophenylphosphate (pNPP)로 수 비 선택은 사용 하는 다른 색도계 분석 결과에 비해 떠들고/트레오닌 인산 가수분해 효소의 활동을 측정 하는 경우 효소32의 광범위 한 수로 dephosphorylated.
상업 공작 석 녹색 키트 PP2A 활동을 측정 하기 위해 몇 시간 동안 사용할 수 그리고 이전 실험실에서 사용 되었다. 그러나, 많은 녹색 공작 석 분석 하 고, 이러한 키트 prohibitively 비싼 되었다. 또한, PP2A 활동에 대 한 상업 키트 1 년 동안만 안정적인 형태 분말 시 약에서 사용할 수 있는 하는 동안 이며 적절 한 스토리지, 오랜 시간에 대 한 구조적으로 안정는 쉽게 사용할 수 분석 결과 구성 요소를 제공.
BSyn 및 gSyn을 테스트 하기 전에 aSyn로 사용 되었다 긍정적인 컨트롤 PP2Ac 활동을 자극 하 고 PP2Ac는 분석 실험에 필요한 양을 결정 하 고 또한 결과 데이터 표준 곡선 (150-2400 pmol 포4 의 규모에 남아 확인 하 ). 그것은 aSyn PP2Ac 자극 하는 경우 너무 강하게 반응이 일반적으로 선형 하지만 데이터 오프 규모 갈 것 이다을 관리 솔루션에 화학 침전, 그건 불가능 한 접시와 함께 출시 된 무료 포4 의 정확한 금액을 측정 하 독자입니다.
기여 하는 aSyn는 PP2Ac 활동 vivo에서 그리고 생체 외에서12,19,21,,2325, 그리고 그 모든 synucleins 상당한 homology, 그것은 있었다 가설 그 모든 synuclein 가족 셀 무료 분석 실험에서 PP2Ac를 자극 수 있습니다. 여기 설명 된 색도계 분석 결과 사용 하 여, 실제로, 모든 3 개의 재조합 synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) PP2Ac 활동, 모든 3 개의 synucleins 신 경계에 비슷한 기능을 수행할 수 있습니다 가능성 제기를 자극 발견 했다. 그러나, 파 킨 슨 병에서 뇌 또는 경우 매우 포함 하는 조직에 있는 더 적은 PP2Ac 활동 Lewy 몸을 가진 치 매 집계 aSyn23. 은닉 Lewy 몸 같은 병 리 또한 전시 마우스 조직 PP2Ac 활동25감소. 이, bSyn도 gSyn 녹는 aSyn의 손실에 대 한 보상 일반적으로 수 좋습니다 그림 3에서 새로운 데이터 뿐만 아니라 aSyn 녹아웃 쥐12, 이전 데이터 및 두뇌, 또는 양자 택일로 그 synuclein homologs 하지 않을 수 있습니다 강하게 표시 (그림 3) aSyn PP2Ac와 연결. 알 렌 두뇌 지도 책 많은 뇌 분야에서는 모든 3 개의 synuclein mRNAs의 colocalization 그리고 비록 트리플 synuclein 녹아웃 쥐 생성 된9,33, PP2Ac 활동은 그 모델에 평가 하지 되었습니다. 흥미롭게도, 폴로-같은 키 2에 의해 Ser129에 phosphorylated aSyn PP2Ac12, 활성화 수 하지만 증거 bSyn에 대 한 여기에 표시 된 아주 작은 bSyn와 함께 온 그 bSyn 인 산화 PP2Ac 활동에 영향을 것입니다 제안 쥐의 뇌 (그림 3)에서 PP2Ac. 함께 찍은, 데이터 aSyn, 가능성이 같은 내 인 성 PP2Ac 활동 변조기 증진과 질병 기여할 것이 좋습니다.
여기에 설명 된 프로토콜 다양 한 치료에 대 한 응답에서 phosphopeptide 기판 dephosphorylate PP2Ac의 용량을 결정 하는 간단 하면서도 강력한 기술입니다. 예를 들어,이 같은 방법론 ceramides로 잠재적인 새로운 치료 학34, 다른 PP2Ac 활성 테스트 또는 PP2Ac 억제제에서 체 외에서의 영향을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 유사한 분석 1D 6 고립 되었다 PP2Ac의 활동을 측정할 수 다는 것을 지적 하는 것이 중요 셀 추출 물 또는 신체 조직, 앞에서 설명한 저자12,19, immunoprecipitation 25. ATP 활동 또한 확인할 수 있습니다 이러한 분석 결과 사용 하 여 공작 석 녹색 분석 결과 대 한 미래 응용 프로그램 PP2Ac 활동, 측정 넘어 존재.
Note 표준 곡선 모든 독립적인 PP2Ac 분석 결과 대 한 각 시간을 생성 해야 합니다. 그것은 자유로운 인산 염 인위적 배경 신호를 증가 하 고 잘못 된 결과가 사용 하는 모든 시 약을 인산 염 무료, 필수입니다. 분석 결과의 날에 모든 샘플 수 분석을 위한 충분 한 신선한 MGT 솔루션 준비 하 필수적 이다. 또한, MGT만 좋은 일입니다 하 그것은 몇 시간 후에 침전 하는 경향이 있다. 공급 업체에서 구입한 PP2Ac aliquotted 이어야 하 고 저장 된 그것은 그것의 활동을 감소 시키는 냉동 해 동 주기를 방지 하기 위해 받은 직후 냉동. 로 다른 가수분해 pT 기판 (예: PP1, PP535), dephosphorylate 수 없는 PP2Ac가 아닌 immunoprecipitation에 의해 고립 되었다 세포 또는 조직 추출, 분석할 때 샘플 무료 인산 염을 제거 하려면 열을 통해 전달 되어야 합니다 그리고 가수분해의 특정 억제제 앞에서 설명한18로 인산 가수분해 효소 특이성을 확인 하는 데 사용 해야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자 켄 드 라 Mackett, 산드라 Slusher와 Jie 첸 메서드를 최적화 하기 위해 일 이전 실험실 구성원의 노력을 주셔서 감사 합니다. 저자는 또한 건강의 국가 학회, 마이클 제이 폭스 재단, 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터 엘 파소 학술 활동 연구 프로젝트 (SARP), Lizanell 및 콜버트 Coldwell 재단, 여러 시스템 위축 연합, 감사 합니다. 오늘 가족 연구, 그리고이 연구의 재정 지원에 대 한 안 나 매도 일 선물 자금.
Reagent | |||
1 M Trizma Base | Sigma-Aldrich | T15003 | |
CaCl2 (calcium chloride) | Fisher Scientific | C70-500 | |
Concentrated HCl | JT Baker | 9535-33 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
Malachite green oxalate salt | Sigma-Aldrich | M6880 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) | New England peptide LLC | BP12-011 | |
KH2PO4 (potassium phosphate) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
Recombinant human PP2A C subunit | Cayman Chemical | 10011237 | |
Recombinant human α-synuclein | rPeptide | S-1001-2 | |
Recombinant human β-synuclein | rPeptide | S-1003-2 | |
Recombinant human γ-synuclein | rPeptide | S-1007-2 | |
PP2Ac 1D6 antibody | Millipore | 05-421 | |
PP2Ac antibody 1D6 | Novus Biologicals | NB100-92217 | |
aSyn antibody C-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
bSyn antibody EP1537Y | Novus Biologicals | NB100-79903 | |
gSyn antibody E-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10698 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo-Fisher Scientific | 89882 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment/Software | |||
Multiskan Spectrum Plate Reader | Thermo Fisher Scientific | 51118650 | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | ||
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AB15P |