Esta publicação apresenta um protocolo mostrando como medir a atividade da proteína recombinante fosfatase 2A catalítico o subunit (PP2Ac) em resposta a recombinante synuclein-α, β-synuclein ou proteínas γ-synuclein usando um simples ensaio colorimetric. Mostramos a conclusões a respeito da especificidade do α-synuclein para PP2Ac no cérebro de rato.
Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) e γ-Synuclein (gSyn) são membros de uma família conservada de acompanhante, como proteínas, que são altamente expressa em tecidos neuronais vertebrados. Das três synucleins, apenas aSyn tem sido fortemente implicada em doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy e atrofia de sistema múltiplo. Do estudo da função normal do aSyn, os dados indicam que aSyn estimula a atividade de subunidade catalítica de uma enzima desfosforilação abundantemente expressa, PP2Ac em vitro e em vivo. Dados anteriores mostram que aSyn agregação no cérebro humano reduz a atividade PP2Ac em regiões com patologia do corpo de Lewy, onde aSyn solúvel tornou-se insolúvel. No entanto, porque todos os três synucleins ter homologia considerável nas sequências de aminoácidos, experimentos foram projetados para testar se todos podem modular a atividade PP2Ac. Usando synucleins recombinante e proteína recombinante PP2Ac, atividade foi avaliada por ensaio colorimetric verde malaquita. Dados revelaram que todos os três synucleins de recombinação estimulada PP2Ac atividade em ensaios sem célula, levantando a possibilidade que a homologia conservada entre synucleins pode dotar todos os três homologs com a capacidade de ligar e ativar o PP2Ac. Dados do co-imunoprecipitação, no entanto, sugerem que modulação PP2Ac provável ocorre por meio de interações endógenas entre aSyn e PP2Ac na vivo.
Estudos, definindo a distribuição de synucleins no cérebro e medula espinhal mostrar que todos os três synucleins ricos em tecidos neurais, apesar de variados padrões de localização foram relataram1. Por exemplo, aSyn é mais abundante em locais pré-sináptica do córtex cerebral e gânglios basais2,3, bSyn tem uma distribuição mais uniforme no cérebro e medula espinhal4,5e gSyn é mais abundante na medula espinhal e gânglios periféricos6. Apesar de poderem ocorrer alguma expressão embrionário de todos os synucleins, os três homologs tornam-se mais abundantes durante o período neonatal4,5,6,7,8. Notavelmente, dados de camundongos nocaute triplo de synuclein, indicam que a perda de todos os três synucleins faz com que idade início disfunção neuronal9, apoiando synuclein importantes funções no sistema nervoso central (SNC)10, 11. ainda não é conhecido se synuclein nocaute triplo ratos mostram alterações na distribuição de PP2Ac ou atividade. Dados de ratos do KO synuclein único revelam que a perda de aSyn sozinho é capaz de reduzir significativamente a atividade de PP2Ac no cérebro12. Além do CNS, todas synucleins localizar para outros tecidos em todo o corpo13,14,15.
Por causa de suas ligações genéticas bem estabelecida a neurodegeneração16,17, aSyn está entre os melhores estudada dos três synucleins. O laboratório Perez há muito tem trabalhado para definir atividades funcionais normais, de aSyn, especialmente no CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 e mais recentemente em tecidos periféricos24,25. Entre estes, foi a descoberta que aSyn desempenha um papel fundamental de regulamentar no estimulante PP2Ac atividade19. PP2A atividade contribui amplamente para a função normal do cérebro, incluindo para a regulação da produção de dopamina26. A holoenzima PP2A consiste de três subunidades independentes, a subunidade catalítica do C, PP2Ac, uma subunidade do andaime A e uma das várias subunidades B de regulamentar/segmentação diferentes que ajudam a localizar PP2A para microdomains subcellular específico, proporcionando assim PP2A diversidade funcional27. Evidências mostram que as interações de aSyn com PP2Ac contribuam significativamente para a sua fosfatase atividade in vitro e in vivo12,19,21,23, 25. Quando aSyn se acumula em agregados de proteínas, como faz quando Lewy corpos forma dentro neurônios de doença de Parkinson e demência com corpos de Lewy (DLB), tecidos com agregados aSyn diminuíram PP2Ac atividade23,25, quando diminuem os níveis de aSyn solúvel. Dado que todos os três synucleins têm significativa homologia28 (aSyn compartilha a identidade de 66%, com bSyn e 56%, com gSyn) e o aSyn contribui para a ativação de PP2Ac, foi hipotetisado que todos os membros da família de proteínas de synuclein podem ser capazes de aumentar a atividade de PP2Ac, pelo menos em vitro. Para avaliar isso, atividade PP2Ac foi medida em resposta a recombinação aSyn, bSyn e gSyn usando um simples ensaio colorimétrico, modelado após o método de Fernandes et al . 29. este método e as romance descobertas estão detalhadas neste documento.
Este ensaio de verde malaquita com pT foi usado para medir a atividade de PP2Ac, porque é mais fácil de realizar do que o método clássico que usa 32P-rotulados substratos. Outra vantagem deste teste sobre ensaios radioativos é que radioisótopos representam um risco e podem ser caros, especialmente 32P-rotulados moléculas que têm meia-vida curta, que limita o número de ensaios, um pode executar antes que expirem os reagentes. Usando o verde malaquita, ao invés de radioatividade também elimina a necessidade de dispor de 32P perde. Ensaios de malaquita verde também são bastante sensíveis ao medir a atividade das fosfatases serina/treonina quando comparado com outro ensaio colorimétrico que utiliza o substrato p-nitrofenilfosfato (pNPP), que é não-seletivo, como pode ser dephosphorylated por um amplo número de enzimas32.
Kits comerciais malaquita verde para medir a atividade de PP2A estão disponíveis há algum tempo e foram anteriormente utilizados em laboratório. No entanto, ao fazer muitos ensaios de verde malaquita, tais jogos tornou-se proibitivamente caros. Além disso, kits comerciais para atividade de PP2A estão estáveis apenas por um ano, enquanto ter disponível em reagentes em pó forma e com armazenamento adequado, fornecem componentes de ensaio prontamente disponíveis que são estruturalmente estáveis por longos períodos de tempo.
Antes de testar a bSyn e gSyn, aSyn foi usado como controle positivo para estimular a atividade de PP2Ac e para determinar a quantidade de PP2Ac necessário para os ensaios e também para confirmar que os dados resultantes permanecem na escala com a curva padrão (150-2400 pmol de PO4 ). Vale ressaltar que se estimula a aSyn PP2Ac também fortemente, que a reação é geralmente linear, dados apaga-se a escala e produtos químicos na solução MGT precipitam, tornando impossível para medir quantidades precisas de lançado livre-PO4 com uma placa leitor.
Dado que o aSyn contribui para PP2Ac atividade in vivo e in vitro12,19,21,23,25e que todos os synucleins homologia considerável, tinha sido a hipótese de que todos os membros da família synuclein podem ser capazes de estimular PP2Ac ensaios em células livre. Usando o ensaio colorimétrico descrito aqui, verificou-se que na verdade, todos os três synucleins de recombinação (aSyn, bSyn, gSyn) estimulada PP2Ac atividade, levantando a possibilidade que todos os três synucleins pode executar funções semelhantes no sistema nervoso. No entanto, o cérebro do mal de Parkinson ou demência com corpo de Lewy casos têm menos atividade PP2Ac em tecidos que contenham altamente agregados aSyn23. Tecidos de mouse abrigando Lewy patologia do corpo, como também apresentam reduziram PP2Ac atividade25. Isto, e novos dados na Figura 3 , bem como dados prévios de aSyn de camundongos nocaute12, sugiro fortemente que nem bSyn nem gSyn normalmente pode compensar a perda de aSyn solúvel em cérebro, ou, alternativamente, que os homologs synuclein não podem associe com PP2Ac tão fortemente quanto aSyn como mostrada (Figura 3). O Atlas do cérebro de Allen mostra o colocalization de todos os três synuclein mRNAs em muitas áreas do cérebro, e embora ratos do KO synuclein triplo foram gerados9,33, PP2Ac atividade não foi avaliada nesse modelo. Curiosamente, aSyn que é fosforilada na Ser129 pela quinase como Polo 2, é menos capaz de ativar o PP2Ac12, mas evidências mostradas aqui para bSyn sugerem que a fosforilação bSyn é improvável afetar a atividade de PP2Ac, como bSyn muito pouco vieram para baixo com PP2Ac no cérebro de rato (Figura 3). Tomados em conjunto, os dados sugerem que endógenos moduladores de atividade de PP2Ac, como aSyn, provavelmente contribuem para o bem-estar e doença.
O protocolo descrito aqui é uma técnica simples contudo poderosa para determinar a capacidade de PP2Ac para dephosphorylate um substrato de Fosfopeptida em resposta a vários tratamentos. Por exemplo, esta mesma metodologia pode ser usada para testar outros ativadores de PP2Ac, como ceramidas, bem como potenciais terapêutica novela34, ou para avaliar o impacto do PP2Ac inibidores em vitro. Também é importante salientar que os ensaios semelhantes podem medir a atividade de PP2Ac que tem sido isolada por 1 6 imunoprecipitação de extratos de células ou tecidos do corpo, como descritos anteriormente por autores12,19, 25. aplicações do futuro para o ensaio de verde malaquita existem além de medir a atividade de PP2Ac, como atividade de ATP também pode ser determinada usando tal um ensaio.
Note que uma curva padrão deve ser gerada a cada vez para cada ensaio de PP2Ac independente. É obrigatório para garantir que todos os reagentes utilizados são fosfato livre, como livre fosfatos artificialmente aumentam o sinal de fundo e produzem resultados errôneos. No dia do ensaio é essencial para preparar bastante fresco MGT solução para todas as amostras ser analisada. Além disso, MGT só é bom no dia em que é feito e tende a precipitar-se depois de algumas horas. PP2Ac comprado de um vendedor deve ser aliquotado e armazenados congelados logo após é recebido para evitar ciclos de degelo de congelamento que reduzem a sua actividade. Como outras fosfatases podem dephosphorylate o substrato pT (por exemplo, PP1 e PP535), ao analisar extratos de célula ou tecido em que o PP2Ac não tiver sido isolada por imunoprecipitação, as amostras devem ser passadas sobre colunas para remover fosfatos livre e inibidores específicos de fosfatases devem ser usados para confirmar a especificidade de fosfatase, como descrito anteriormente,18.
The authors have nothing to disclose.
Os autores apreciam os esforços por membros do laboratório prévia Kendra Mackett e Sandra Slusher Jie Chen que trabalhou para otimizar o método. Os autores também agradecer o National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University saúde ciências centro El Paso acadêmicos atividade pesquisa projeto (SARP), Lizanell e Colbert Coldwell Foundation, coalizão de atrofia múltiplo sistema, Pesquisa da família de Hoy e Anna Mae Doyle presente fundos de apoio financeiro desta pesquisa.
Reagent | |||
1 M Trizma Base | Sigma-Aldrich | T15003 | |
CaCl2 (calcium chloride) | Fisher Scientific | C70-500 | |
Concentrated HCl | JT Baker | 9535-33 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
Malachite green oxalate salt | Sigma-Aldrich | M6880 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) | New England peptide LLC | BP12-011 | |
KH2PO4 (potassium phosphate) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
Recombinant human PP2A C subunit | Cayman Chemical | 10011237 | |
Recombinant human α-synuclein | rPeptide | S-1001-2 | |
Recombinant human β-synuclein | rPeptide | S-1003-2 | |
Recombinant human γ-synuclein | rPeptide | S-1007-2 | |
PP2Ac 1D6 antibody | Millipore | 05-421 | |
PP2Ac antibody 1D6 | Novus Biologicals | NB100-92217 | |
aSyn antibody C-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
bSyn antibody EP1537Y | Novus Biologicals | NB100-79903 | |
gSyn antibody E-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10698 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo-Fisher Scientific | 89882 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment/Software | |||
Multiskan Spectrum Plate Reader | Thermo Fisher Scientific | 51118650 | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | ||
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AB15P |