Esta publicación presenta un protocolo que muestra cómo medir la actividad de la subunidad catalítica de una 2A de fosfatasa proteína recombinante (PP2Ac) en respuesta a recombinante α-sinucleína, β-sinucleína o γ-sinucleína proteínas usando un simple análisis colorimétrico. Mostramos resultados con respecto a α-sinucleína especificidad hacia PP2Ac en cerebro de ratón.
(Vinagre) de α-sinucleína, β-sinucleína (bSyn) y γ-sinucleína (gSyn) son miembros de una familia conservada de proteínas chaperonas-como que son altamente expresada en los tejidos neuronales vertebrados. De las tres synucleins, sólo vinagre se ha implicado fuertemente en trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy y atrofia del sistema múltiple. En el estudio de función de vinagre normal, los datos indican que vinagre estimula la actividad de la subunidad catalítica de una enzima dephosphorylating abundantemente expresado, PP2Ac in vitro e in vivo. Datos anteriores muestran que aSyn agregación en cerebro humano reduce PP2Ac actividad en regiones con patología del cuerpo de Lewy, donde aSyn soluble se ha convertido en insoluble. Sin embargo, porque todos tres synucleins tienen considerable homología en las secuencias del aminoácido, experimentos fueron diseñados para probar si todo puede modular la actividad de PP2Ac. Usando synucleins recombinantes y proteínas recombinantes de la PP2Ac, actividad se evaluó por análisis colorimétrico de verde de Malaquita. Los datos revelaron que todos tres synucleins recombinantes estimula la actividad de PP2Ac en los ensayos libres de células, levantando la posibilidad que la homología conservada entre synucleins puede dotar todos tres homólogos con la capacidad de atar a y activar el PP2Ac. Sin embargo, los datos de co-inmunoprecipitación, sugieren que PP2Ac modulación probablemente ocurre mediante interacciones endógenas entre vinagre y PP2Ac en vivo.
Estudios definir la distribución de synucleins en cerebro y médula espinal que todos tres synucleins están enriquecidos en los tejidos neuronales, aunque diferentes patrones de localización se han reportado1. Por ejemplo, vinagre es más abundante en los sitios presinápticos en la corteza cerebral y ganglios basales2,3, bSyn tiene una distribución más uniforme en el cerebro y la médula espinal4,5y gSyn es más abundante en la médula espinal y los ganglios periféricos6. Aunque puede ocurrir alguna expresión embrionaria de todos synucleins, los tres homólogos se convierten en más abundantes durante el período neonatal4,5,6,7,8. Sorprendentemente, los datos de sinucleína triple nocaut ratones, indican que la pérdida de todos los tres synucleins causas edad Inicio disfunción neuronal9, sinucleína importantes funciones de apoyo en el sistema nervioso central (SNC)10, 11. no se sabe todavía si sinucleína triple nocaut ratones muestran cambios en la distribución de PP2Ac o actividad. Datos de ratones knockout de sinucleína solo revelan que la pérdida de vinagre solo es capaz de reducir significativamente la actividad de PP2Ac en cerebro12. Además del CNS, synucleins todos localizar a otros tejidos en el cuerpo13,14,15.
Debido a sus vínculos genéticos bien establecidos con neurodegeneración16,17, aSyn es uno de los mejores estudiado de las tres synucleins. El laboratorio Perez ha trabajado mucho tiempo para definir las actividades funcionales normales del vinagre, especialmente en el CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 y más recientemente en los tejidos periféricos24,25. Entre éstos, fue el descubrimiento que vinagre juega un papel regulador clave en el estimulante PP2Ac actividad19. PP2A actividad contribuye ampliamente a la función normal del cerebro, incluyendo la regulación de la producción de dopamina26. El holoenzyme PP2A consta de tres subunidades independientes, la subunidad catalítica de la C, PP2Ac, una subunidad de andamios A y uno de varios regulador/dirigido a B subunidades diferentes que ayudan a localizar PP2A a microdominios subcelulares específicos, proporcionando así PP2A diversidad funcional27. Evidencia muestra que las interacciones de vinagre con PP2Ac contribuyen significativamente a su fosfatasa actividad in vitro e in vivo12,19,21,23, 25. Cuando el vinagre se acumula en los agregados de proteína, como lo hace cuando Lewy cuerpos forma dentro de las neuronas de la enfermedad de Parkinson y demencia con cuerpos de Lewy (DLB), tejidos con vinagre agregado han disminuido PP2Ac actividad23,25, cuando niveles de aSyn soluble disminuyen. Dado que todos tres synucleins tienen homología significativa28 (aSyn comparte identidad de 66% con bSyn y el 56% con gSyn) y ese vinagre contribuye a la activación de PP2Ac, fue presumido que todos los miembros de la familia de proteínas de sinucleína pueden ser capaces aumentar la actividad de PP2Ac, al menos en vitro. Para evaluar esto, PP2Ac la actividad fue medida en respuesta a recombinante aSyn, bSyn y gSyn usando un simple análisis colorimétrico, modelado después del método de Fathi et al. 29. este método y los nuevos hallazgos se detallan en este documento.
Este ensayo de verde de Malaquita con pT se utilizó para medir la actividad de PP2Ac porque es más fácil de realizar que el método clásico que utiliza substratos marcado con P 32. Otra ventaja de este ensayo sobre los ensayos radiactivos es que radioisótopos suponen cierto riesgo y pueden ser costosos, especialmente 32P etiquetados las moléculas que tienen una vida media corta, que limita el número de ensayos se puede realizar antes de vencen de reactivos. Utilizar verde de Malaquita en lugar de radiactividad también elimina la necesidad de disponer de 32residuos P. Ensayos de verde de Malaquita son también muy sensibles al medir la actividad de fosfatasas de serina/treonina en comparación con un ensayo colorimétrico que utiliza el sustrato p-nitrophenylphosphate (pNFF), que es no selectivo, como puede ser defosforilaciones por un amplio número de enzimas32.
Kits comerciales verde de Malaquita para medir actividad de PP2A han estado disponibles por algún tiempo y fueron utilizados previamente en el laboratorio. Sin embargo, al hacer muchos ensayos de verde de Malaquita, estos kits se convirtió en prohibitivos. Además, kits comerciales para la actividad de PP2A son estables solamente por un año, mientras que tener disponible en los reactivos en polvo forma y con almacenamiento adecuado, proporcionan los componentes del ensayo disponibles que son estructuralmente estables durante largos períodos de tiempo.
Antes de la prueba bSyn y gSyn, vinagre fue utilizado como control positivo para estimular la actividad de PP2Ac y para determinar la cantidad de PP2Ac requeridos para los ensayos y también para confirmar que siendo datos resultantes de la escala con la curva estándar (150-2400 pmol de PO4 ). Es de destacar que si el vinagre estimula la PP2Ac demasiado fuertemente, aunque la reacción es típicamente lineal, datos se apagarán la escala y precipitan sustancias químicas en la solución MGT, haciendo imposible medir cantidades precisas de lanzado PO libre4 con una placa de lector.
Dado que el vinagre contribuye a PP2Ac actividad en vivo y en vitro12,19,21,23,25y que todos synucleins tienen homología considerable, había sido la hipótesis de que todos los miembros de familia de sinucleína pueden ser capaces de estimular la PP2Ac en ensayos libres de la célula. Mediante el ensayo colorimétrico descrito aquí, se encontró que de hecho, todas tres synucleins recombinantes (vinagre, bSyn, gSyn) estimula la actividad de PP2Ac, levantando la posibilidad que todos tres synucleins puede llevar a cabo funciones similares en el sistema nervioso. Sin embargo, cerebro de la enfermedad de Parkinson o demencia con cuerpos de Lewy casos tienen menos actividad de PP2Ac en los tejidos que contienen altamente agregado vinagre23. Tejidos de ratón albergar Lewy cuerpo-como patología también exhiben reducen PP2Ac actividad25. Esto, y nuevos datos en la figura 3 , así como datos previos de aSyn nocaut ratones12, sugiere que ni bSyn ni gSyn típicamente puede compensar por la pérdida de aSyn soluble en cerebro, o alternativomente que los homólogos de sinucleína pueden no asociado con PP2Ac tan fuertemente como aSyn como se muestra (figura 3). El Atlas Allen del cerebro muestra colocalización de todos tres mRNAs de sinucleína en muchas áreas del cerebro, y aunque ratones knockout de sinucleína triple ha generado9,33, PP2Ac actividad no ha sido evaluada en ese modelo. Curiosamente, vinagre que es fosforilado en Ser129 por el Polo-como quinasa 2, es menos capaz de activar PP2Ac12, pero se muestra aquí para bSyn las pruebas indican que la fosforilación bSyn es poco probable que impacto actividad PP2Ac, como bSyn muy poco se vino con PP2Ac en cerebro de ratón (figura 3). Tomados en conjunto, los datos sugieren que endógeno PP2Ac moduladores de la actividad, como vinagre, probablemente contribuyen a bienestar y enfermedad.
El protocolo descrito aquí es una simple pero poderosa técnica para determinar la capacidad de PP2Ac al dephosphorylate un sustrato de fosfopéptidos en respuesta a diversos tratamientos. Por ejemplo, puede utilizarse esta misma metodología a prueba otros activadores de PP2Ac, como ceramidas y potencial terapéutica novela34, o para evaluar el impacto de los inhibidores de la PP2Ac en vitro. También es importante señalar que análisis similares pueden medir la actividad del PP2Ac que ha sido aislado por 1 6 inmunoprecipitación de extractos celulares o tejidos del cuerpo, como se ha descrito por los autores12,19, 25. aplicaciones de futuro para el ensayo de malaquita verde existen más allá de la medición de la actividad PP2Ac, como actividad de ATP también puede ser determinado mediante un ensayo de tal.
Tenga en cuenta que se debe generar una curva estándar cada vez para cada ensayo independiente del PP2Ac. Es obligatorio para garantizar que todos los reactivos utilizados son fosfato libre, como libres fosfatos artificialmente aumentan la señal de fondo y producen resultados erróneos. En el día de la prueba es esencial preparar suficiente solución MGT fresca para todas las muestras a ensayarse. También, MGT es solamente buena el día en que se hace y tiende a precipitar después de unas horas. PP2Ac de adquirir de un vendedor deben ser alicuotados y almacenado congelado poco después de que se recibe para evitar ciclos de descongelación de congelación que reducen su actividad. Como otras fosfatasas pueden dephosphorylate el sustrato de pT (e.g. PP1 y PP535), al analizar los extractos de célula o tejido en el que PP2Ac no ha sido aislado por inmunoprecipitación, muestras deben pasarse sobre las columnas para eliminar fosfatos libres y específicos inhibidores de fosfatasas deben utilizarse para confirmar la especificidad de la fosfatasa, como se describió anteriormente18.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecemos los esfuerzos de los miembros del laboratorio previo Kendra Mackett, Sandra Slusher y Jie Chen que han trabajado para optimizar el método. Los autores también agradecen los institutos nacionales de salud, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University salud Ciencias centro El Paso estudiante actividad investigación proyecto (SARP), Lizanell y Colbert Coldwell Fundación, coalición de atrofia de sistema múltiple, Investigación de familia hoy y Anna Mae Doyle regalo fondos de apoyo financiero de esta investigación.
Reagent | |||
1 M Trizma Base | Sigma-Aldrich | T15003 | |
CaCl2 (calcium chloride) | Fisher Scientific | C70-500 | |
Concentrated HCl | JT Baker | 9535-33 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
Malachite green oxalate salt | Sigma-Aldrich | M6880 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) | New England peptide LLC | BP12-011 | |
KH2PO4 (potassium phosphate) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
Recombinant human PP2A C subunit | Cayman Chemical | 10011237 | |
Recombinant human α-synuclein | rPeptide | S-1001-2 | |
Recombinant human β-synuclein | rPeptide | S-1003-2 | |
Recombinant human γ-synuclein | rPeptide | S-1007-2 | |
PP2Ac 1D6 antibody | Millipore | 05-421 | |
PP2Ac antibody 1D6 | Novus Biologicals | NB100-92217 | |
aSyn antibody C-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
bSyn antibody EP1537Y | Novus Biologicals | NB100-79903 | |
gSyn antibody E-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10698 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo-Fisher Scientific | 89882 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment/Software | |||
Multiskan Spectrum Plate Reader | Thermo Fisher Scientific | 51118650 | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | ||
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AB15P |