Bu yayın rekombinant α-synuclein, β-synuclein veya basit bir kolorimetrik yöntemi kullanarak γ-synuclein protein karşılık olarak rekombinant protein fosfataz 2A katalitik alt birimi (PP2Ac) etkinliğini ölçmek nasıl gösteren bir protokolü sunar. Fare beyninde PP2Ac doğru α-synuclein özgüllük ile ilgili bulgular göstermektedir.
Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) ve γ-Synuclein (gSyn) son derece omurgalı nöronal dokularda ifade edilir refakatçi gibi proteinler korunmuş bir ailenin üyesidir. Üç synucleins sadece aSyn şiddetle nörodejeneratif hastalıklarda Parkinson hastalığı, demans Lewy organları ve birden çok sistem Atrofi gibi karıştığı olmuştur. Normal aSyn işlevi okumak, o aSyn bir katalitik alt birimi bir bol ifade dephosphorylating enzimi, PP2Ac içinde in vitro ve in vivoaktivitesi uyarır verileri belirtmek. Önceki veriler aSyn toplama insan beyninin içinde PP2Ac aktivite ile Lewy body patoloji, nerede çözünür aSyn çözünmez hale gelmiştir bölgelerde azaltır göstermektedir. Ancak, tüm üç synucleins amino asit serilerinde önemli homoloji olduğundan, deneyler tüm PP2Ac aktivite modüle Eğer test etmek için tasarlanmıştır. Rekombinant synucleins ve rekombinant PP2Ac protein kullanarak, etkinlik malakit yeşil Renkölçer tahlil tarafından değerlendirildi. Veri tüm üç rekombinant synucleins synucleins arasında korunmuş homoloji bağlamak ve PP2Ac harekete geçirmek için yeteneği ile tüm üç homologs bağışlamak olasılığını yükseltmek, boş hücre deneyleri faaliyete PP2Ac uyarılmış saptandı. Co-immunoprecipitation verileri, ancak, PP2Ac modülasyon muhtemel aSyn ve PP2Ac in vivoarasındaki endojen etkileşimler yoluyla oluşur göstermektedir.
Yerelleştirme değişen kalıpları olmasına rağmen synucleins dağıtım beyin ve omurilik gösteri tüm üç synucleins sinirsel dokularda zenginleştirilmiş tanımlama çalışmaları1bildirdi. Örneğin, aSyn,2,3serebral korteks ve Bazal gangliyon presynaptic sitelerdeki en bol olduğu, bSyn beyin ve omurilik4,5‘ te daha düzgün bir dağılımı gösterir ve gSyn omurilik daha bol ve periferik gangliyon6. Her ne kadar tüm synucleins bazı embriyonik ifade ortaya çıkabilir, üç homologs neonatal dönem4,5,6sırasında,7,8daha bol olmak. Dikkat çekici, synuclein Tek Kişilik nakavt fareler, verileri göstermek tüm üç synucleins kaybı merkezi sinir sistemi (MSS)10‘, önemli synuclein fonksiyonları destekleyerek yaş başlangıçlı nöronal fonksiyon bozukluğu9, neden olur 11. Eğer synuclein üçlü nakavt fareler değişiklikleri kaldırma veya PP2Ac dağıtım henüz bilinmemektedir. Tek synuclein nakavt fareler verilerinden ortaya çıkarmak aSyn yalnız kaybı önemli ölçüde beyin12PP2Ac etkinliğini azaltmak yapabiliyor. CNS yanı sıra diğer dokulara vücut13,14,15boyunca tüm synucleins belirle.
Ateş16,17, köklü genetik bağlantıları nedeniyle, aSyn en iyileri arasında üç synucleins incelenmiştir. Perez laboratuvar uzun aSyn, normal işlevsel faaliyetler özellikle CNS11,12,18,19‘,20,21tanımlamak için çalıştı, 22,23 ve son zamanlarda periferik dokulara24,25. Bunlar arasında o aSyn keşif uyarıcı PP2Ac etkinlik19‘ önemli bir düzenleyici rol oynar. PP2A faaliyet normal beyin fonksiyonu, dopamin üretim26düzenlenmesi için de dahil olmak üzere yaygın olarak katkıda bulunur. PP2A holoenzyme oluşan üç bağımsız alt birimleri, katalitik C alt birimi, PP2Ac, iskele A alt birim ve PP2A böylece PP2A sağlayan belirli hücre altı microdomains için yerelleştirilmesine yardımcı çeşitli farklı düzenleyici/hedefleme B alt biri İşlevsel Çeşitlilik27. Kanıt PP2Ac ile aSyn etkileşimleri onun fosfataz aktivitesi vitro ve in vivo12,19,21,23önemli ölçüde katkıda bulunmak gösterir, 25. Lewy organları nöronlar içinde şeklinde Parkinson hastalığı ve demans Lewy organları (DLB) ile zaman olduğu gibi aSyn protein toplamları, biriken zaman toplanan aSyn kurcalayarak PP2Ac etkinliği23,25azaldı, ne zaman çözünür aSyn düzeylerini azaltmak. Verilen bu önemli homoloji28 tüm üç synucleins var (aSyn hisse % 66 kimlik bSyn ve gSyn ile % 56) ve bu aSyn PP2Ac harekete geçirmek katkıda bulunur, synuclein protein ailesinin tüm üyeleri, mümkün olabileceğini onaylanmadığına karar En azından PP2Ac aktivite artışı vitro. Bunu değerlendirmek için PP2Ac etkinlik rekombinant aSyn, bSyn ve gSyn basit bir kolorimetrik yöntemi, Fathi vd. yöntemin ardından örnek alınarak kullanarak yanıt ölçüldü 29. bu yöntem ve yeni bulgular burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Bu malakit yeşil tahlil pT ile 32P etiketli yüzeylerde kullanan klasik yöntem gerçekleştirmek daha kolay olduğu için PP2Ac etkinliği ölçmek için kullanıldı. Başka bir avantaj radyoaktif deneyleri Bu testin olduğunu radioisotopes biraz riskli ve pahalı olabilir, özellikle 32P etiketli molekülleri bu kısa yarı-hayat, var hangi reaktifler süresi sona ermeden önce bir gerçekleştirebilirsiniz deneyleri sayısını sınırlar. Radyoaktivite da 32tanesi imha etme gereksinimini ortadan kaldırır malakit yeşil yerine P atık. Malakit yeşil deneyleri de olabildiğince seçici sigara olan substrat p-nitrophenylphosphate (pNPP), kullanan başka bir Renkölçer tahlil karşılaştırıldığında serin/treonin fosfatazlar etkinliğini ölçerken oldukça duyarlıdır enzimler32geniş bir dizi tarafından dephosphorylated.
PP2A etkinliği ölçmek için ticari malakit yeşil kitleri bir süre için mevcut olmuştur ve daha önce laboratuvar olarak kullanılmıştır. Ancak, birçok malakit yeşil deneyleri yaparken böyle kitleri çok pahalı oldu. Buna ek olarak, PP2A faaliyet için ticari kitleri reaktifler elde edilebilir içinde sahip toz formu sadece bir yıl için kararlı iken ve uygun depolama ile uzun bir süre için yapısal istikrarlı hazır tahlil bileşenleri sağlar.
BSyn ve gSyn test etmeden önce aSyn olumlu bir denetim olarak PP2Ac etkinliği teşvik etmek ve deneyleri için gerekli PP2Ac miktarını belirlemek için ve de sonuçta elde edilen veriler standart eğri (150-2400 pmol PO4 ile ölçekte kalır onaylamak için kullanılmıştır ). Bu aSyn PP2Ac uyarır çok güçlü tepki genellikle doğrusal olmasına rağmen veri ölçeği geçer yoksa ve kimyasallar MGT çözüm çökelti, doğru miktarda yayımlanan Ücretsiz PO4 bir plaka ile ölçmek imkansız hale olduğunu dikkat çekicidir okuyucu.
Verilen bu aSyn katkıda PP2Ac aktivite içinde vivo ve in vitro12,19,21,23,25ve bu önemli homoloji tüm synucleins var, o olmuştu Tüm synuclein aile üyeleri PP2Ac hücre ücretsiz deneyleri uyarmak mümkün olabileceğini onaylanmadığına karar. Burada açıklanan Renkölçer tahlil kullanarak, gerçekten de, tüm üç rekombinant synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) PP2Ac etkinlik, tüm üç synucleins sinir sisteminde benzer işlevleri gerçekleştirebilir olasılığını yükseltmek teşvik bulundu. Ancak, Parkinson beyin veya demans Lewy durumlarda son derece içeren dokulara daha az PP2Ac etkinliğine sahip beden ile toplanan aSyn23. Fare dokulara vücut benzeri patoloji Ayrıca sergi Lewy yataklık PP2Ac etkinlik25azalttı. Bu, ve şekil 3 ‘ deki yeni verilerinizi yanı sıra önceki veri aSyn nakavt fareler12, şiddetle tavsiye ederim ne bSyn ne de gSyn genellikle çözünür aSyn kaybı telafi edebilirsiniz beyin veya bu alternatif olarak bu synuclein homologs olmayabilir PP2Ac ile aSyn olarak gösterilmiştir (şekil 3) olarak güçlü ilişkilendirin. Allen beyin Atlas tüm üç synuclein mRNA’ların colocalization birçok beyin alanda gösterir ve yine de üçlü synuclein nakavt fareler oluşturulan9,33, etkinlik bu modelde değerlendirildi değil PP2Ac olmuştur. İlginçtir, üzerinde Ser129 Polo gibi kinaz 2, fosforile aSyn PP2Ac12etkinleştirmek daha az yetenekli, ama burada bSyn için gösterilen kanıt önermek gibi ile çok az bSyn indi bSyn fosforilasyon PP2Ac etkinlik, etkisi pek mümkün değildir PP2Ac fare beyin (şekil 3). Birlikte ele alındığında, veri aSyn, büyük olasılıkla gibi endojen PP2Ac aktivite modülatörler sağlık ve hastalık katkıda öneririz.
Burada özetlenen Protokolü phosphopeptide substrat yanıt çeşitli tedaviler olarak dephosphorylate için PP2Ac kapasitesini belirlemek için basit ama güçlü bir tekniktir. Örneğin, bu aynı metodoloji Seramidler yanı sıra potansiyel roman therapeutics34, gibi diğer PP2Ac harekete geçirmek test etmek veya PP2Ac inhibitörleri vitroetkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Benzer deneyleri 1 d 6 tarafından izole PP2Ac etkinliğini ölçebilirsiniz işaret etmek önemlidir hücre özleri veya vücut dokuları, daha önce açıklanan yazarlar12,19tarafından, immunoprecipitation 25. gelecekteki uygulamalar malakit yeşil tahlil için mevcut PP2Ac etkinlik, ölçüm ötesinde gibi ATP etkinliği bir tahlil kullanarak da belirlenebilir.
Unutmayın, her zaman her bağımsız PP2Ac tahlil için standart bir eğri oluşturulmalıdır. Tüm reaktifler kullanılan fosfat ücretsiz, ücretsiz fosfatlar yapay olarak arka plan sinyal artırmak ve hatalı sonuçlar gibi olduğundan emin olmak için zorunludur. Tahlil günün denenecektir tüm örnekleri için yeterli taze MGT çözüm hazırlamak için esastır. Ayrıca, MGT sadece yapılmış ve birkaç saat sonra çökelti eğilimi gün iyidir. Bir satıcıdan satın PP2Ac aliquotted olmalı ve depolanan yakında onun etkinliğini azaltmak donma çözülme döngüsü önlemek için aldıktan sonra donmuş. Diğer fosfatazlar pT substrat (örneğin PP1 ve PP535), dephosphorylate gibi hangi PP2Ac değil izole immunoprecipitation tarafından hücre veya doku özleri analiz ederken örnekleri ücretsiz fosfatlar kaldırmak için sütunları geçirilmesi gereken ve fosfatazlar belirli inhibitörleri fosfataz özgüllük, yukarıda açıklanan18olarak onaylamak için kullanılması gerekir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar tarafından önceden laboratuvar üyeleri Kendra Mackett, Sandra Slusher ve yöntemi en iyi duruma getirmek için çalışan Jie Chen çaba için teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca Ulusal Sağlık enstitüleri, Michael J. Fox Vakfı, Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi El Paso bilimsel etkinlik araştırma projesi (SARP), Lizanell ve Colbert Coldwell Vakfı, birden çok sistem Atrofi koalisyon teşekkür ederiz, Hoy aile araştırma ve Anna Mae Doyle hediye fonları finansal destek bu araştırma için.
Reagent | |||
1 M Trizma Base | Sigma-Aldrich | T15003 | |
CaCl2 (calcium chloride) | Fisher Scientific | C70-500 | |
Concentrated HCl | JT Baker | 9535-33 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
Malachite green oxalate salt | Sigma-Aldrich | M6880 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) | New England peptide LLC | BP12-011 | |
KH2PO4 (potassium phosphate) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
Recombinant human PP2A C subunit | Cayman Chemical | 10011237 | |
Recombinant human α-synuclein | rPeptide | S-1001-2 | |
Recombinant human β-synuclein | rPeptide | S-1003-2 | |
Recombinant human γ-synuclein | rPeptide | S-1007-2 | |
PP2Ac 1D6 antibody | Millipore | 05-421 | |
PP2Ac antibody 1D6 | Novus Biologicals | NB100-92217 | |
aSyn antibody C-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
bSyn antibody EP1537Y | Novus Biologicals | NB100-79903 | |
gSyn antibody E-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10698 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo-Fisher Scientific | 89882 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment/Software | |||
Multiskan Spectrum Plate Reader | Thermo Fisher Scientific | 51118650 | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | ||
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AB15P |