Controllabile Espressione Ion Canale attraverso inducibile trasfezione transiente

Summary

Studiare canali ionici, attraverso un sistema di espressione eterologhi è diventata una tecnica di base nella ricerca biomedica. In questo manoscritto, presentiamo un metodo efficiente tempo per realizzare canali ionici strettamente controllato eseguendo trasfezione transiente sotto il controllo di un promotore inducibile.

Abstract

Trasfezione, la consegna di acidi nucleici estranei in una cella, è un potente strumento di ricerca proteine. Attraverso questo metodo, i canali ionici possono essere studiati attraverso l'analisi elettrofisiologiche, caratterizzazione biochimica, gli studi mutazionali, e loro effetti sui processi cellulari. trasfezioni transienti offrono un semplice protocollo in cui la proteina diventa disponibile per l'analisi entro poche ore o giorni. Anche se questo metodo presenta un protocollo efficiente relativamente semplice e tempo, uno dei componenti critici sta calibrando l'espressione del gene di interesse a livelli fisiologicamente importanti o livelli che sono adatti per l'analisi. A tal fine, molti approcci diversi che offrono la possibilità di controllare l'espressione del gene di interesse sono emersi. Diversi protocolli di trasfezione delle cellule stabili forniscono un modo per introdurre in modo permanente un gene di interesse nel genoma cellulare, ai sensi del regolamento di un transcrip tetraciclina controllatoattivazione zionale. Mentre questa tecnica produce livelli di espressione affidabili, ogni gene di interesse richiede alcune settimane di lavoro qualificato, fra cui tarature di una curva di uccisione, la selezione di colonie di cellule, e in generale più risorse. Qui vi presentiamo un protocollo che utilizza trasfezione transiente del potenziale canale cationico membro sottofamiglia V 1 gene Transient Receptor (TRPV1) in un sistema inducibile come un modo efficace per esprimere una proteina in un modo controllato, che è essenziale per l'analisi dei canali ionici. Abbiamo dimostrato che l'utilizzo di questa tecnica, siamo in grado di effettuare l'imaging di calcio, cellula intera, e l'analisi monocanale con livelli dei canali controllati richiesti per ogni tipo di raccolta dati con un unico trasfezione. Nel complesso, questo fornisce una tecnica replicabile che può essere utilizzato per studiare struttura e funzione canali ionici.

Introduction

Esprimendo eterologhi sistemi è una delle tecniche più utilizzate per studiare un gran numero di funzioni cellulari ^1. Il loro profilo basso endogena di proteine, minima necessità di manutenzione, la crescita affidabile, e la capacità di intraprendere e di esprimere DNA estraneo hanno fatto linee cellulari quali embrionale umano Rene (HEK293) e ovaio di criceto cinese (CHO) quasi indispensabile per la ricerca biologica ^{2, 3.} Le aree di ricerca che utilizza sistemi eterologhi includono proteine ​​di membrana, di segnalazione intracellulare, e l'attività enzimatica. A seguito di trasfezione di DNA estraneo all'interno della cellula, molte diverse forme di analisi possono essere eseguite, tra cui elettrofisiologia, l'imaging del calcio raziometrico, Western Blot, ecc ^{4, 5.}

A causa della vasta gamma di potenziali applicazioni per i sistemi di espressione eterologa, molti differereagenti e prodotti nt sono stati sviluppati per utilizzare queste cellule e le loro qualità ^6. sistemi di consegna del DNA che si integrano in modo transitorio o permanente DNA estraneo nelle cellule per studiare proteina esogena è diventato uno degli strumenti più popolari e utili per la ricerca biologica. Più specificamente, transitoriamente trasfezione del DNA in una cellula è ampiamente usato come un semplice processo avanti, rettilineo che richiede relativamente poco tempo e materiali. Inoltre, il tasso di successo di cellule che subiscono trasfezione è alto ^7. Questa tecnica è molto affidabile quando combinato con un gene marcatore come proteina fluorescente verde (GFP), e può essere utilizzato per diverse tecniche come l'imaging calcio e elettrofisiologia ^5. Purtroppo, però, esprimono transitoriamente DNA nelle cellule ospiti viene fornito con alcune importanti insidie, non in meno che il livello di espressione per cellule è inaffidabile. Il numero di copie di DNA plasmidico taken up per cella è incontrollabile, quindi l'espressione tra i singoli esperimenti può variare notevolmente ^2. Questo problema diventa significativo quando uno tenta di replicare le condizioni fisiologiche, o l'esecuzione di precise tecniche di raccolta dei dati.

Come soluzione a complicazioni menzionati sopra, i protocolli di trasfezione stabili sono stati progettati in cui un gene di interesse può essere inserito nel genoma di una cellula sotto stretto controllo di un promotore inducibile, ad esempio un sistema tetraciclina repressore espressione, assicurando una singola copia del plasmide integra nel genoma di ciascuna cella e viene espresso solo dopo l'induzione del meccanismo di trascrizione, per esempio, in presenza di doxiciclina. Mentre questo risolve gli ostacoli di livelli di espressione proteica incoerenti, questo metodo perde la comodità di protocollo rapido e relativamente semplice trasfezioni transitorie. Stabilire una linea cellulare stabile richiede almeno un paio di settimane in which si deve calibrare una curva di uccisione fissato antibiotici specifici per mantenere l'espressione proteica e garantire l'integrazione del vettore e abilmente selezionare e crescere colonie di cellule. Nel complesso questo richiede molto più tempo e fatica con un tasso di successo più bassa ^8.

Qui, vi presentiamo un protocollo intermedio che si basa sui punti di forza di entrambe le opzioni di trasfezione popolari per fornire un modo semplice ed efficace per controllare i livelli di espressione in qualsiasi linea cellulare inducibile. Pur mantenendo le cellule con un sistema tet inducibile, abbiamo transitoriamente trasfezione nostro gene di interesse, Transient Receptor Potential canale cationico membro sottofamiglia V 1 (TRPV1), legatura in un vettore che può homologously coniugare con il sistema repressore. In questo modo, il gene può essere introdotto nelle cellule senza cominciando a esprimere. Solo con l'aggiunta di doxiciclina non gene comincia a esprimere, ci permette di calibrare i livelli di proteine ​​exprESSIONE secondo la tecnica o livelli osservati in condizioni fisiologiche. Il nostro protocollo evita anche complicanze lunghe associati con la generazione di una linea cellulare che esprime stabilmente. Iniziamo mostrando i livelli mutevoli di attivazione TRPV1 nella diagnostica per immagini del calcio da un-indotta attraverso quattro ore di induzione e come l'aumento dei livelli intracellulari di calcio correlato. Abbiamo quindi duplicare il protocollo in tutta la configurazione della cella della tecnica del patch clamp, mostrando l'attuale aumento con il tempo di induzione crescente. Infine, vi presentiamo alcuni esempi di registrazioni elettrofisiologiche singoli canali, e dimostrare che questa tecnica è particolarmente utile per espressione controllata quando alla ricerca di raccolta di dati precisi sulla base di singole unità della proteina. Attraverso il nostro protocollo, offriamo un modo comodo per controllare l'espressione della proteina in sistemi eterologhi, evitando lunghe complicazioni di coltura cellulare, fornendo così un modo per controllare le condizioni tra esperimenti e fornire mori risultati replicabili.

Protocol

1. legatura il gene di interesse nella reprimibile sito del vettore Ottenere un vettore inducibile come pcDNA5 / FRT / TO o pcDNA4 / TO. Analizzare il gene di interesse per tutti i siti di restrizione potenzialmente sensibili nel mezzo del gene che sono anche presenti nel sito di clonaggio multiplo del vettore scelto dal DNA in silico software di analisi 4. Uso sovrapposizione PCR standard tecniche 4, fiancheggiano il gene di interes…

Representative Results

Per creare rapidamente un modello di espressione inducibile, abbiamo fatto uso di cellule HEK293 che esprimono tetraciclina repressore della proteina (TR) (ad esempio, T-Rex-293) e vettori che contengono sequenze di operatore tetraciclina (Teto) tra il promotore CMV e il sito di clonazione multiplo (ad esempio, pcDNA4 / TO). Quando trasfettata in TREX-293 cellule, l'espressione del gene di interesse in pcDNA4 / TO è repressa, come TR lega al teto. Aggiunta di doxic…

Discussion

Transfection è un protocollo ampiamente usato per l'espressione della proteina e di ricerca, con molte varianti per migliorare l'espressione di coerenza e stabilità. reagenti di trasfezione transiente offrono un semplice, facile da usare protocollo in cui la cellula e la proteina di interesse possono essere analizzati in poche ore a tutta la notte dal momento della trasfezione. Purtroppo questo approccio può essere imprevedibile se la modalità di analisi richiede un livello costante di espressione della prot…

Materials

pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler	Esco	n.a
Restriction Enzymes	ThermoScientific Fisher	ER0501
Agarose	Lonza	50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 DNA Ligase	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Bio	A-301-5
Tryptone for microbiology	Merck	6.19305E+13
Yeast Extract	BD worldwide	212750
SIF6000R Incubated Shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin®plasmid	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V Power Supply	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 cell line	Invitrogen	R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Buffer	NEB	B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin	Gibco	10270106
HEPES Buffer Solution (1 M)	Biological Industries	03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)	Biological Industries	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet	ThermoScientific Fisher	51025411
Blasticidine S hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round	Knittel Glass	GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine	Corning	354210
Water, Cell Culture Grade	Biological Industries	03-055-1A
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM ester	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Capsaicin	Tocris	462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope	Olympus	n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher	Sutter Instruments	n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera	QImaging	n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software	Molecular Devices	n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma-Aldrich	276855
P1000 micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
ValveBank perfusion sysytem	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System	Molecular Devices	n.a
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	n.a
pCLAMP 10.6 Software	Molecular Devices	n.a
micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225