ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף
Summary
תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.
Abstract
Transfection, המסירה של חומצות גרעין זרים לתא, הוא כלי רב עוצמה במחקר חלבון. באמצעות שיטה זו, ניתן לחקור תעלות יונים באמצעות ניתוח אלקטרו, אפיון ביוכימי, מחקרים מוטאציות, והשפעתם על תהליכים תאיים. transfections חלוף להציע פרוטוקול פשוט שבו החלבון הופך המנותחת תוך מספר שעות עד ימים. אמנם שיטה זו מציגה פרוטוקול יחסי פשוט זמן יעיל, אחד המרכיבים הקריטיים הוא לכיול הביטוי של הגן של ריבית לרמות נהוגות פיסיולוגיות רלוונטיות או רמות שאינן מתאימים לניתוח. לשם כך, גישות שונות רבות המציעות את היכולת לשלוט על הביטוי של הגן של עניין צמחו. מספר פרוטוקולי התא transfection היציבים לספק דרך להציג גן של עניין לצמיתות לגנום התא תחת הרגולציה של transcrip טטרציקלין שבשליטההפעלה תזונתית. אמנם שיטה זו מייצרת רמות ביטוי אמינות, כל גן של עניין דורש כמה שבועות של עבודה המיומנת כולל כיול עקום הרג, בחירה של מושבות תאים, ובסך הכילו יותר משאבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול המשתמשת transfection חולף של V subfamily ערוץ קטיון פוטנציאל חלוף קולטן חבר 1 (TRPV1) גנים מערכת מושרה כדרך יעילה להביע חלבון באופן מבוקר שהוא חיוני בניתוח ערוץ יון. אנו מראים כי באמצעות טכניקה זו, אנו מסוגלים לבצע הדמיה סידן, התא כולו, וניתוח ערוץ אחד עם רמות ערוץ נשלט הנדרש לכל סוג של איסוף נתונים עם transfection יחיד. בסך הכל, זה מספק טכניקה לשכפול, שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את המבנה תעלות יונים ותפקוד.
Introduction
Heterologously להביע מערכות היא אחת הטכניקות המקובלות ביותר ללמוד מספר רב של פונקציות הסלולר 1. פרופיל חלבון אנדוגני הנמוך שלהם, דרישות תחזוקה מינימאליות, צמיחה אמינה, והיכולת תופסת ולהביע דנ"א זר הפכו שורות תאים כגון כליה העוברית האנושי (HEK293) וסינית אוגר שחלה (CHO) כמעט חיונית למחקר ביולוגי 2, 3. תחומי מחקר באמצעות מערכות Heterologous כוללים חלבונים בממברנה, איתות תאית, ואת פעילות האנזימטית. בעקבות transfection של דנ"א זר לתוך התא, צורות שונות של ניתוח יכול להתבצע, לרבות אלקטרופיזיולוגיה, הדמיה סידן ratiometric, כתם המערבי, וכו '4, 5.
בשל המגוון הרחב של יישומים פוטנציאליים למערכות ביטוי Heterologous, differe רבריאגנטים ומוצרים NT פותחו לנצל תאים אלה והאיכויות שלהם -6. מערכות משלוח דנ"א זמני או לצמיתות לשלב דנ"א זר לתאים ללמוד חלבון אקסוגני הפך לאחד הכלים הפופולריים ביותר ושימושי למחקר ביולוגי. באופן ספציפי יותר, זמני DNA transfecting לתא נעשה שימוש נרחב כתהליך פשוט, ישר קדימה הדורש מעט זמן יחסית וחומרים. יתר על כן, שיעור תאי ההצלחה לעבור transfection הוא גבוה 7. טכניקה זו היא מאוד אמינה כאשר הוא משולב עם גן סמן כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), וניתן להשתמש בו עבור טכניקות שונות כגון הדמית סידן אלקטרופיזיולוגיה 5. למרבה הצער, אם כי, זמני להביע דנ"א לתוך תאי מארחים מגיע עם כמה מלכודות גדולות, לא כהוא זה כי רמת הביטוי לכל תא אינה מהימנה. מספר העותקים של ה- DNA פלסמיד נלקח up לכל תא הוא בלתי נשלט, ולכן הביטוי בין ניסויים בודדים יכול להשתנות במידה רבה 2. סוגיה זו מקבלת משמעותי כאשר אחד מנסה לשכפל מצבים פיזיולוגיים, או ביצוע טכניקות אוסף נתונים מדויקים.
כפתרון הסיבוכים הנ"ל, פרוטוקולי transfection יציבים עוצבו שבו גן של עניין יכול להיות מוכנס לתוך הגנום של תא תחת הפיקוח ההדוק של אמרגן מושרה, כגון מערכת ביטוי המדכא טטרציקלין, הבטחה יחידה עותק של פלסמיד משתלב בגנום של כל תא ובא לידי ביטוי רק לאחר גיוס של מנגנון שעתוק, למשל, בנוכחות דוקסיציקלין. אמנם זה פותר את המכשולים של רמות ביטוי חלבון עולות בקנה אחד, שיטה זו מאבדת את הנוחות של פרוטוקול מהיר ויחסית פשוט של transfections חולף. הקמת קו תאים יציבות לוקח לפחות כמה שבועות which יש לכייל עקומת הרג שקבע אנטיביוטיקה ספציפית כדי לשמור על ביטוי החלבון ולהבטיח שילוב של וקטור ובמיומנות לבחור ולגדול מושבות תאים. בסך הכל זה לוקח הרבה יותר זמן ומאמץ עם שיעור הצלחה נמוך 8.
הנה, אנחנו מציגים פרוטוקול ביניים שמושך על נקודות החוזק של שתי אפשרויות transfection הפופולריות לספק דרך פשוטה ויעילה לשלוט ברמות ביטוי בכל שורת תאים מושרה. תוך שמירת תאים עם מערכת ט מושרה, אנו transfect הגן שלנו זמני של עניין, ערוץ קטיון פוטנציאל חלוף קולטן V subfamily חבר 1 (TRPV1), ligated לתוך וקטור כי ניתן לשלב homologously עם המערכת המדכאת. בדרך זו, הגן יכול להיות מוחדר לתאים ללא מתחילים להביע. רק עם התוספת של דוקסיציקלין אין הגן מתחיל להביע, מה שמאפשר לנו לכייל את רמות expr החלבוןession פי הטכניקה או הרמות שנצפו בתנאים פיסיולוגיים. הפרוטוקול שלנו גם ימנע סיבוכים ארוכים לפריסת יצירת קו תא להביע ביציבות. אנחנו מתחילים על ידי הצגת הרמות המשתנות של הפעלת TRPV1 בתחום הדמית סידן בלתי להתהוות מתוך ארבע שעות של אינדוקציה ואיך עליית רמות סידן תאי בקורלציה. לאחר מכן, אנו לשכפל את פרוטוקול בתצורת התא כולו של הטכניקה מהדק תיקון, מראה הזרם הגובר עם הגדלת זמן של אינדוקציה. לבסוף, אנו מציגים דוגמאות של קלטות אלקטרופיזיולוגיה ערוץ אחד, ונראה כי טכניקה זו שימושית במיוחד עבור ביטוי מבוקר כאשר מחפשים אוסף נתונים מדויק על בסיס של יחידת פרט של החלבון. באמצעות הפרוטוקול שלנו, אנו מציעים דרך נוחה לשלוט ביטוי חלבון במערכות Heterologous תוך הימנעות סיבוכי תרבית תאים ממושכים, ובכך לספק דרך לשלוט בתנאים בין ניסויים ולספק מומחדש תוצאות לשכפול.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transfection הוא פרוטוקול בשימוש נרחב עבור ביטוי חלבון ומחקר, עם וריאציות שונות כדי לשפר את עקביות ביטוי ויציבות. ריאגנטים transfection החולפים מציעים פשוט, קל לשימוש פרוטוקול שבו התא לחלבון של עניין ניתן לנתח בתוך שעות הלילה מהרגע של transfection. למרבה הצער גישה זו יכולה להיות בלתי ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע [מענקי 1721/12, 1368/12, 1444/16 ו] (כדי AP). AP מזוהה עם Brettler מרכז ודוד ר בלום מרכז, בית הספר לרוקחות, האוניברסיטה העברית בירושלים.
Materials
| pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102020 | |
| pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V103320 | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Swift™ MaxPro Thermal Cycler | Esco | n.a | |
| Restriction Enzymes | ThermoScientific Fisher | ER0501 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoScientific Fisher | ND-2000C | |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific Fisher | EL0011 | |
| One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli | ThermoScientific Fisher | C404006 | |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Bio | A-301-5 | |
| Tryptone for microbiology | Merck | 6.19305E+13 | |
| Yeast Extract | BD worldwide | 212750 | |
| SIF6000R Incubated Shaker | LAB COMPANION | 45H118 | |
NucleoSpin®plasmid |
Macherey Nagel | 740588.25 | |
| MS 300V Power Supply | Major Science | MP-300V | |
| Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System | ThermoScientific Fisher | B1A | |
| T-REx™-293 cell line | Invitrogen | R710-07 | |
| DMEM (1X), liquid (high glucose) | Gibco | 41965-039 | |
| HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
| ApaI | NEB | R0114S | |
| CutSmart® Buffer | NEB | B7204S | |
| pcDNA™6/TR Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102520 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco | 10270106 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) | Biological Industries | 03-022-1B | |
| Heracell™ 150i CO2 Incubator | ThermoScientific Fisher | 51026406 | |
| MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet | ThermoScientific Fisher | 51025411 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER | Hausser Scientific | 31000 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| TransIT®-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round | Knittel Glass | GG-12 | |
| BioCoat™ Poly-D-Lysine | Corning | 354210 | |
| Water, Cell Culture Grade | Biological Industries | 03-055-1A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Fura-2, AM ester | Biotium | BTM-50034 | |
| Pluronic® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| µ-Slide 8 Well | ibidi | 80826 | |
| (E)-Capsaicin | Tocris | 462 | |
| Olympus IX70 Fluorescence Microscope | Olympus | n.a | |
| Lambda DG-4 Wavelength Switcher | Sutter Instruments | n.a | |
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera | QImaging | n.a | |
| MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software | Molecular Devices | n.a | |
| Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
| Standard Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MF-900 Microforge | NARISHIGE | n.a | |
| ValveBank perfusion sysytem | AutoMate Scientific | ||
| Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System | Molecular Devices | n.a | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | n.a | |
| pCLAMP 10.6 Software | Molecular Devices | n.a | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 |
Riferimenti
- Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization. Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Xu, X., Nagarajan, H., et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
- Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry. Scientific reports. 5, 12278 (2015).
- Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics. Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells. Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain. Cell. 141 (5), 834-845 (2010).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).
- Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels. J Vis Exp. (71), e4209 (2013).
