Kontrollerbar Ion Channel Expression gjennom induserbar Transient Transfeksjon

Summary

Studerer ionekanaler gjennom et heterologt uttrykke systemet har blitt en sentral teknikk i biomedisinsk forskning. I dette manuskriptet presenterer vi en tidseffektiv metode for å oppnå kontrollert ionekanal ekspresjon ved å utføre transient transfeksjon under kontroll av en induserbar promoter.

Abstract

Transfeksjon, levering av utenlandske nukleinsyrer i en celle, er et kraftig verktøy i protein forskning. Gjennom denne fremgangsmåte, kan ionekanaler undersøkes ved elektrofysiologisk analyse, biokjemiske karakterisering, mutasjonsstudier, og deres virkninger på celleprosesser. Forbigående transfeksjoner har en enkel protokoll hvori proteinet blir tilgjengelig for analyse i løpet av noen timer til dager. Selv om denne fremgangsmåten gir en relativt enkel og tidseffektiv protokollen, er en av de kritiske komponentene kalibrering av ekspresjon av genet av interesse for fysiologiske relevante nivåer eller nivåer som er egnet for analyse. For dette formål er mange forskjellige tilnærminger som tilbyr muligheten til å styre ekspresjonen av genet av interesse dukket opp. Flere stabile celle transfeksjonsteknologier protokoller gir en måte å introdusere fast et gen av interesse i det cellulære genomet under regulering av en tetracyklin-kontrollerte transcripelle aktivering. Selv om denne teknikken gir pålitelige uttrykk nivåer, hvert gen av interesse krever et par uker med dyktige arbeid inkludert kalibrering av et drap kurve, valg av cellekolonier, og generelt mer ressurser. Her presenterer vi en protokoll som bruker transient transfeksjon av Transient Receptor Potential kation kanal-underfamilien V medlem 1 (TRPV1) -genet i et induserbart system som en effektiv måte for å uttrykke et protein på en kontrollert måte, som er essensielt i ionekanal analyse. Vi viser at ved hjelp av denne teknikken, er vi i stand til å utføre kalsium bildebehandling, hele cellen, og én kanal analyse med kontrollerte kanalnivå for hver type datainnsamling med et enkelt transfeksjon. Alt i alt gir dette en replikerbar teknikk som kan brukes til å studere ionekanaler struktur og funksjon.

Introduction

Heterologt uttrykke systemer er en av de mest brukte teknikker for å studere en rekke cellulære funksjoner ^1. Deres lav endogen protein profil, minimalt vedlikeholdsbehov, pålitelig vekst, og evne til å ta opp og uttrykke fremmed DNA har gjort cellelinjer som humane embryonale nyre (HEK293) og kinesiske hamstere (CHO) nesten avgjørende for biologisk forskning ^{to, tre.} Områder i forskning ved hjelp av heterologe systemer inkluderer membranproteiner, intracellulære signal og enzymatisk aktivitet. Etter transfeksjon av fremmed DNA inn i cellen, kan mange forskjellige former for analyse skal utføres, herunder elektrofysiologi, ratiometrisk avbildning kalsium, western blot, etc. ^{4, 5.}

På grunn av det brede utvalget av mulige bruksområder for heterologe ekspresjonssystemer, mange different reagenser og produkter er blitt utviklet for å utnytte disse cellene og deres kvaliteter ^6. DNA leveringssystemer som forbigående eller permanent integrere fremmed DNA i cellene til å studere eksogent protein har blitt en av de mest populære og nyttige verktøy for biologisk forskning. Nærmere bestemt er forbigående transfeksjon av DNA inn i en celle mye brukt som en enkel, likefrem prosess som krever forholdsvis liten tid og materialer. Videre er suksessraten av celler som gjennomgår transfeksjon høy ^7. Denne teknikken er meget pålitelig når det kombineres med et markør-gen, slik som grønt fluorescent protein (GFP), og kan brukes til mange forskjellige teknikker så som kalsium avbildning og elektro ^5. Dessverre, men forbigående uttrykker DNA inn i vertsceller kommer med noen store fallgruvene, ikke i det minste at uttrykket nivået per celle er upålitelig. Antallet kopier av plasmid DNA tatt up per celle er ukontrollerbare, således uttrykket mellom de enkelte eksperimenter kan variere sterkt ^2. Dette problemet blir betydelig når en prøver å gjenskape fysiologiske forhold, eller utføre presise datainnsamling teknikker.

Som en løsning på de komplikasjoner som er nevnt ovenfor, stabil transfeksjon protokoller er utviklet i hvilken et gen av interesse kan settes inn i genomet til en celle under streng kontroll av en induserbar promoter, for eksempel en tetracyklin repressor ekspresjonssystem, noe som sikrer en enkel kopi av plasmidet integreres inn i genomet til hver celle, og er bare uttrykt etter induksjon av transkripsjon mekanisme, for eksempel i nærvær av doksycyklin. Selv om dette løser hindringer av inkonsistente protein uttrykk nivåer, mister denne metoden bekvemmeligheten av rask og relativt enkel protokoll av forbigående trans. Etablering av en stabil cellelinje tar minst et par uker i hh man må kalibrere et drepende kurve satt av bestemte antibiotika for å opprettholde den proteinekspresjon og sørge for integrering av vektoren og dyktig velge ut og dyrke cellekolonier. Samlet er dette tar betydelig mer tid og krefter med en lavere suksessrate ^8.

Her introduserer vi en mellom protokoll som trekker på styrken av både av de populære transfeksjonsagensene alternativer for å gi en enkel og effektiv måte å kontrollere uttrykk nivåer i en induserbar cellelinje. Samtidig opprettholde celler med en induserbar tet system, vi forbigående transfektere vår genet av interesse, Transient Receptor Potential kasjon kanal underfamilie V medlem 1 (TRPV1), ligert inn i en vektor som homologously kan kombinere med repressor system. På denne måten, kan genet bli introdusert inn i cellene uten begynner å uttrykke. Bare med tillegg av doksycyklin har genet begynne å uttrykke, tillater oss å kalibrere nivåer av protein expression i henhold til teknikken eller nivåene observert i fysiologiske betingelser. Vår protokoll unngår også langvarige komplikasjoner forbundet med å generere et stabilt uttrykkende cellelinje. Vi begynner med å vise de endrede nivåer av TRPV1 aktivering i kalsium avbildning fra un-indusert gjennom fire timer med induksjon og hvordan økningen i intracellulære kalsiumnivå korrelerer. Vi deretter kopiere protokollen i hele cellekonfigurasjon av plasteret klemmeteknikken, som viser økende strøm med økende tid av induksjon. Til slutt presenterer vi eksempler på enkeltkanalelektrofysiologi opptak, og viser at denne teknikken er spesielt nyttig for kontrollert uttrykk når vi leter etter nøyaktig datainnsamling basert på individuelle enheter av protein. Gjennom vår protokoll, kan vi tilby en enkel måte å kontrollere protein uttrykk i heterologe systemer og samtidig unngå lange cellekultur komplikasjoner, og dermed gi en måte å kontrollere forholdene mellom eksperimenter og gi more kopier resultater.

Protocol

1. ligere genet inn i repressible Site of Vector Skaff en induserbar vektor som pcDNA5 / FRT / TO eller pcDNA4 / TO. Analyser genet av interesse for noen potensielt følsomme restriksjonsseter i midten av genet som er også omtalt i flere kloning området av valgt vektor av i silico DNA analyse programvare 4. Ved hjelp av standard PCR-teknikker overlappings 4, flankerer genet av interesse med to utvalgte restriksjonsenzymgjenkjenning…

Representative Results

For raskt å opprette en induserbar uttrykk modell, har vi gjort bruk av HEK293 celler som uttrykker Tetracycline Repressor protein (TR) (for eksempel T-Rex-293) og vektorer som inneholder tetracyklin operatorsekvenser (Teto) mellom CMV promoteren og multiple kloningssete (f.eks pcDNA4 / TO). Når transfektert inn Trex-293 celler, er uttrykket av genet av interesse i pcDNA4 / TO trykt, som TR binder seg til Teto. Tilsetning av doxycycline til mediet forhindrer TR-Teto i…

Discussion

Transfeksjon er en mye brukt protokoll for protein uttrykk og forskning, med mange forskjellige varianter for å bedre uttrykk konsistens og stabilitet. Forbigående transfeksjon reagenser tilbyr en enkel, lett å bruke protokoll der cellen og protein av interesse kan analyseres i løpet av timer til over natten fra tidspunktet for transfeksjon. Dessverre denne tilnærmingen kan være uforutsigbar når modusen for analyse krever et konsistent nivå av protein uttrykk, for eksempel enkeltkanalopptak i elektro <sup class=…

Materials

pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler	Esco	n.a
Restriction Enzymes	ThermoScientific Fisher	ER0501
Agarose	Lonza	50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 DNA Ligase	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Bio	A-301-5
Tryptone for microbiology	Merck	6.19305E+13
Yeast Extract	BD worldwide	212750
SIF6000R Incubated Shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin®plasmid	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V Power Supply	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 cell line	Invitrogen	R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Buffer	NEB	B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin	Gibco	10270106
HEPES Buffer Solution (1 M)	Biological Industries	03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)	Biological Industries	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet	ThermoScientific Fisher	51025411
Blasticidine S hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round	Knittel Glass	GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine	Corning	354210
Water, Cell Culture Grade	Biological Industries	03-055-1A
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM ester	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Capsaicin	Tocris	462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope	Olympus	n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher	Sutter Instruments	n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera	QImaging	n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software	Molecular Devices	n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma-Aldrich	276855
P1000 micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
ValveBank perfusion sysytem	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System	Molecular Devices	n.a
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	n.a
pCLAMP 10.6 Software	Molecular Devices	n.a
micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225