Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Summary

Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível.

Abstract

A transfecção, a entrega de ácidos nucleicos estranhos numa célula, é uma ferramenta poderosa na pesquisa de proteínas. Através deste método, os canais iónicos pode ser investigada através de análise electrofisiológica, caracterização bioquímica, estudos mutacionais, e os seus efeitos sobre os processos celulares. As transfecções transientes oferecer um protocolo simples, em que a proteína se torna disponível para análise em poucas horas ou dias. Embora este método apresenta um protocolo de tempo relativamente simples e eficiente, um dos componentes críticos é calibrar a expressão do gene de interesse a níveis fisiológicos relevantes ou níveis que são adequados para análise. Para este fim, muitas abordagens diferentes, que oferecem a capacidade de controlar a expressão do gene de interesse têm surgido. Vários protocolos de transfecção de células estáveis ​​fornecem uma maneira de introduzir de forma permanente um gene de interesse no genoma celular sob a regulação de um transcrip controlado por tetraciclinaactivação cional. Embora essa técnica produz níveis de expressão de confiança, cada gene de interesse requer algumas semanas de trabalho qualificado, nomeadamente calibração de uma curva de morte, seleção de colônias de células e, em geral mais recursos. Aqui apresenta-se um protocolo que utiliza a transfecção transitória do canal de catiões Potencial membro da subfamília V um gene transiente do receptor (TRPV1) num sistema indutível de uma maneira eficiente para expressar uma proteína de uma forma controlada que é essencial na análise de canal iónico. Nós demonstramos que usando esta técnica, somos capazes de realizar imagem de cálcio, células inteiras, e análise único canal com os níveis dos canais controlados necessários para cada tipo de coleta de dados com uma única transfecção. No geral, esta técnica fornece uma replicáveis ​​que podem ser usadas para estudar a estrutura e função de canais iónicos.

Introduction

Sistemas de expressão heteróloga é uma das técnicas mais amplamente utilizado para estudar uma multiplicidade de funções celulares ^1. Seu perfil baixo endógena de proteína, os requisitos mínimos de manutenção, o crescimento confiável e capacidade de assumir e expressar DNA estranho fizeram linhas celulares tais como embrionárias humanas de rim (HEK293) e ovário de hamster chinês (CHO) quase essencial para a pesquisa biológica ^{2, 3.} Áreas de pesquisa usando sistemas heterólogos incluem proteínas de membrana, sinalização intracelular e atividade enzimática. A seguir à transfecção de ADN estranho na célula, muitas formas diferentes de análise pode ser realizada, incluindo a electrofisiologia, imagem de cálcio raciométrica, western blot, etc ^{4, 5.}

Devido à grande variedade de aplicações potenciais para sistemas de expressão heterólogos, muitos difereReagentes e produtos nt foram desenvolvidos para utilizar estas células e as suas qualidades ^6. sistemas de entrega de DNA que transitoriamente ou permanentemente integrar DNA estranho em células para estudar proteína exógena tornou-se uma das ferramentas mais populares e úteis para a pesquisa biológica. Mais especificamente, a transfecção transiente de ADN para uma célula é amplamente usado como um processo para a frente simples, linear que requer relativamente pouco tempo e materiais. Além disso, a taxa de sucesso de células que sofrem transfecção é alta ^7. Esta técnica é muito fiável quando combinado com um gene marcador tal como a proteína fluorescente verde (GFP), e pode ser usado para muitas técnicas diferentes, como a imagiologia de cálcio e electrofisiologia ^5. Infelizmente, no entanto, que expressam transitoriamente o DNA em células hospedeiras vem com alguns dos principais armadilhas, não menos que o nível de expressão por célula não é fiável. O número de cópias do DNA de plasmídeo feita up por célula é incontrolável, assim, a expressão entre experiências individuais podem variar muito ^2. Esta questão torna-se significativo quando quer tentar replicar condições fisiológicas, ou a realização de técnicas precisas de coleta de dados.

Como uma solução para as complicações acima mencionadas, os protocolos de transfecção estável foram concebidos em que um gene de interesse pode ser inserido no genoma de uma célula sob o controlo apertado de um promotor indutível, tal como um sistema de tetraciclina repressor expressão, assegurando uma única cópia do plasmídeo se integra no genoma de cada célula e só é expressa após a indução do mecanismo de transcrição, por exemplo, na presença de doxiciclina. Enquanto isso resolve os obstáculos de níveis de expressão de proteína inconsistentes, este método perde a conveniência de protocolo rápido e relativamente simples de transfecções transitórias. O estabelecimento de uma linha de células estável leva pelo menos algumas semanas em which uma necessário calibrar uma curva de morte definido por antibióticos específicos para manter a expressão da proteína e assegurar a integração do vector e habilmente seleccionar e fazer crescer colónias de células. No geral, isto leva muito mais tempo e esforço com uma menor taxa de sucesso ^8.

Aqui, apresentamos um protocolo intermediário que tem por base os pontos fortes de ambas as opções de transfecção populares para fornecer uma maneira simples e eficaz para controlar os níveis de expressão em qualquer linha de células inducible. Enquanto se mantém as células com um sistema tet indutível, que transientemente transfectar nosso gene de interesse, transiente do receptor potencial canal de catião membro da subfamília V 1 (TRPV1), ligado a um vector que pode homologamente combinar com o sistema de repressor. Deste modo, o gene pode ser introduzido nas células sem começando a expressar. Apenas com a adição de doxiciclina não o gene começam a expressar, o que nos permite calibrar os níveis de proteína exprESSÃO de acordo com a técnica ou níveis observados em condições fisiológicas. Nosso protocolo também evita complicações associadas à geração de longas uma linha celular que expressa de forma estável. Começamos mostrando alteração dos níveis de ativação de TRPV1 na imagem de cálcio a partir de-un induzida através de quatro horas de indução e como o aumento dos níveis de cálcio intracelular está correlacionado. Em seguida, duplicar o protocolo em toda a configuração da célula da técnica de patch-clamp, mostrando o aumento da corrente com o tempo de indução a aumentar. Por fim, apresentamos exemplos de gravações de eletrofisiologia único canal, e mostrar que esta técnica é especialmente útil para a expressão controlada quando se olha para a coleta de dados precisos com base em unidades individuais da proteína. Através do nosso protocolo, que oferecem um modo conveniente de controlar a expressão de proteínas em sistemas heterólogos, evitando longas complicações de cultura de células, proporcionando assim uma maneira de controlar as condições de entre experiências e fornecer MOre resultados replicáveis.

Protocol

1. ligando o gene de interesse no site reprimível da Vector Obter um vector indutível, como pcDNA5 / FRT / TO ou pcDNA4 / TO. Analisar o gene de interesse para quaisquer locais de restrição potencialmente sensíveis existentes no meio do gene que também estão presentes no local de clonagem múltiplo do vector escolhido por ADN em silico software de análise 4. Utilizando técnicas de PCR padrão de sobreposição 4, flanquear o…

Representative Results

Para criar rapidamente um modelo de expressão indutível, que feita utilização de células HEK293 que expressam a proteína Tetraciclina repressor (TR) (por exemplo, T-REX-293) e vectores que contêm sequências do operador de tetraciclina (TetO) entre o promotor CMV e o local de clonagem múltipla (por exemplo, pcDNA4 / A). Quando transfectado em células TRex-293, a expressão do gene de interesse em pcDNA4 / A é reprimida, tal como a TR liga TetO. A adição de d…

Discussion

Transfecção é um protocolo amplamente utilizado para a expressão da proteína e da pesquisa, com muitas variações diferentes para melhorar a consistência e a estabilidade de expressão. reagentes de transfecção transitória oferecer um método simples, fácil de usar o protocolo em que a célula e a proteína de interesse pode ser analisado dentro de horas ou durante a noite a partir do momento da transfecção. Infelizmente, esta abordagem pode ser imprevisível quando o modo de análise requer um nível consi…

Materials

pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler	Esco	n.a
Restriction Enzymes	ThermoScientific Fisher	ER0501
Agarose	Lonza	50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 DNA Ligase	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Bio	A-301-5
Tryptone for microbiology	Merck	6.19305E+13
Yeast Extract	BD worldwide	212750
SIF6000R Incubated Shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin®plasmid	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V Power Supply	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 cell line	Invitrogen	R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Buffer	NEB	B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin	Gibco	10270106
HEPES Buffer Solution (1 M)	Biological Industries	03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)	Biological Industries	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet	ThermoScientific Fisher	51025411
Blasticidine S hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round	Knittel Glass	GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine	Corning	354210
Water, Cell Culture Grade	Biological Industries	03-055-1A
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM ester	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Capsaicin	Tocris	462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope	Olympus	n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher	Sutter Instruments	n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera	QImaging	n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software	Molecular Devices	n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma-Aldrich	276855
P1000 micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
ValveBank perfusion sysytem	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System	Molecular Devices	n.a
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	n.a
pCLAMP 10.6 Software	Molecular Devices	n.a
micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225