Kontrollerbar jonkanalen uttryck genom inducerbara Transient transfektion

Summary

Studera jonkanaler genom ett heterologt uttrycka systemet har blivit en kärntekniken i biomedicinsk forskning. I detta manuskript, presenterar vi en tidseffektiv metod för att uppnå hårt kontrollerad jonkanalen expression genom att utföra transient transfektion under kontroll av en inducerbar promotor.

Abstract

Transfektion, leveransen av främmande nukleinsyror i en cell, är ett kraftfullt verktyg i proteinforskning. Genom denna metod kan jonkanaler undersökas genom elektrofysiologiska analys, biokemisk karakterisering, mutationsstudier, och deras effekter på cellulära processer. Transienta transfektioner erbjuda ett enkelt protokoll i vilka proteinet blir tillgänglig för analys inom några timmar till dagar. Även om denna metod uppvisar en relativt enkel och tids effektiva protokollet, är en av de kritiska komponenterna kalibrering av uttryck av genen av intresse för fysiologiska relevanta nivåer eller nivåer som är lämpliga för analys. För detta ändamål har många olika tillvägagångssätt som erbjuder förmågan att kontrollera uttrycket av den intressanta genen uppstått. Flera stabila cell transfektion protokoll ett sätt att permanent införa en gen av intresse i det cellulära genomet under reglering av en tetracyklin styrd transcriptionell aktivering. Även om denna teknik ger tillförlitliga uttrycksnivåer, varje gen av intresse kräver några veckors kvalificerat arbete, bland annat kalibrering av ett dödande kurva, val av cellkolonier, och totalt sett mer resurser. Här presenterar vi ett protokoll som använder övergående transfektion av Transient Receptor Potential ning kanal subfamily V medlem 1 (TRPV1) gen i ett inducerbara systemet som ett effektivt sätt att uttrycka ett protein på ett kontrollerat sätt som är viktigt i jonkanalen analys. Vi visar att användningen av denna teknik, har vi möjlighet att utföra kalcium avbildning, hela cellen, och en kanal analys med kontrollerade kanalnivåer som krävs för varje typ av datainsamling med en enda transfektion. Sammantaget ger detta en replikerbar teknik som kan användas för att studera jonkanaler struktur och funktion.

Introduction

Heterologt uttrycka system är ett av de mest använda tekniker för att studera en mängd cellulära funktioner ^1. Deras låg endogen proteinprofil, minimala underhållsbehov, tillförlitlig tillväxt och förmåga att ta upp och uttrycka främmande DNA har gjort cellinjer såsom humana embryonala njur (HEK293) och kinesisk hamsterovarie (CHO) nästan nödvändig för biologisk forskning ^{2, 3.} Forskningsområden med hjälp av heterologa system inkluderar membranproteiner, intracellulär signalering och enzymatisk aktivitet. Efter transfektion av främmande DNA in i cellen, kan utföras många olika former av analys, inklusive elektro, ratiometrisk kalcium avbildning, western blöt, etc. ^{4, 5.}

På grund av det stora utbudet av potentiella tillämpningar för heterologa expressionssystem, många different reagens och produkter har utvecklats för att använda dessa celler och deras egenskaper ^6. DNA leveranssystem som övergående eller permanent integrera främmande DNA in i celler för att studera exogena proteinet har blivit en av de mest populära och användbara verktyg för biologisk forskning. Mer specifikt är transient transfektion av DNA i en cell i stor utsträckning som en enkel, rättfram process som kräver relativt lite tid och material. Dessutom är andelen framgångsrika celler som genomgår transfektion hög ^7. Denna teknik är mycket pålitlig när de kombineras med en markörgen, såsom grönt fluorescerande protein (GFP), och kan användas för många olika tekniker, såsom kalcium avbildning och elektrofysiologi ^5. Men tyvärr, transient uttrycka DNA i värdceller kommer med några stora fallgropar, inte minst att expressionsnivån per cell är opålitlig. Antalet kopior av plasmid-DNA tas up per cell är okontrollerbar, alltså uttryck mellan enskilda experiment kan variera kraftigt ^två. Denna fråga blir betydande när antingen försöker reproducera fysiologiska förhållanden, eller utföra exakta datainsamlingstekniker.

Som en lösning på de komplikationer som nämnts ovan, stabil transfektion protokoll har utformats i vilka en gen av intresse kan infogas i genomet hos en cell under strikt kontroll av en inducerbar promotor, såsom en tetracyklin-repressor-expressionssystem, vilket garanterar en enda kopia av plasmiden integreras i genomet i varje cell och uttrycks endast efter induktion av transkriptionsmekanismen, till exempel, i närvaro av doxycyklin. Även om detta löser hinder av inkonsekventa proteinuttrycksnivåer, förlorar denna metod att underlätta för snabbt och relativt enkelt protokoll för transienta transfektioner. Inrättande av en stabil cellinje tar minst ett par veckor i which måste man kalibrera en dödande kurvsats av särskilda antibiotika för att upprätthålla proteinuttryck och säkerställa integration av vektorn och skickligt välja och odla cellkolonier. Sammantaget tar betydligt mer tid och ansträngning med en lägre framgång ^8.

Här presenterar vi en mellan protokoll som bygger på styrkan i både av de populära transfektion alternativ för att ge ett enkelt och effektivt sätt att kontrollera expressionsnivåer i alla inducerbara cellinje. Under upprätthållande av celler med en inducerbar tet-system, vi transient transfektera vår gen av intresse, Transient Receptor Potential katjon kanalunderfamiljen V medlem 1 (TRPV1), ligeras in i en vektor som homologt kan kombinera med den repressorsystemet. På detta sätt kan genen introduceras i cellerna utan börjar att uttrycka. Endast med tillsats av doxycyklin inte genen börjar uttrycka, vilket tillåter oss att kalibrera nivåerna av protein expression enligt tekniken eller nivåer som observerats i fysiologiska betingelser. Vår protokoll undviker också långa komplikationer i samband med att generera en stabilt uttryckande cellinje. Vi börjar med att visa de förändrade nivåer av TRPV1 aktivering på kalcium avbildning från un-inducerad genom fyra timmars induktion och hur ökningen av intracellulära kalciumnivåer korrelerar. Vi duplicera sedan protokollet i konfigurationen hela cellen i patch clamp-tekniken, visar ökande ström med ökande tid av induktion. Slutligen presenterar vi exempel på enkanaliga elektrofysiologiska inspelningar, och visar att denna teknik är speciellt användbar för kontrollerad expression när man letar efter insamling exakta uppgifter grundar sig på enskilda enheter av proteinet. Genom våra protokoll, erbjuder vi ett bekvämt sätt att kontrollera proteinuttryck i heterologa system samtidigt som man undviker långa cellodlings komplikationer, vilket ger ett sätt att kontrollera förhållanden mellan experiment och ge more repliker resultat.

Protocol

1. ligering Genen av intresse i den undertryck Site Vector Skaffa en inducerbar vektor såsom pcDNA5 / FRT / TILL eller pcDNA4 / TO. Analysera den intressanta genen för eventuella potentiellt mottagliga restriktionsställen i mitten av genen som också finns med i det multipla kloningsstället av den valda vektorn genom in silico DNA-analys programvara 4. Med användning av standard-överlappande PCR-tekniker 4, flankerar genen av i…

Representative Results

För att snabbt skapa en inducerbar uttryck modell, gjorde vi användning av HEK293-celler som uttrycker Tetracyklin repressor protein (TR) (t.ex. T-Rex-293) och vektorer som innehåller tetracyklin operatorsekvenser (Teto) mellan CMV-promotorn och det multipla kloningsstället (t.ex., pcDNA4 / TO). När den transfekteras in i TREX-293-celler, är uttrycket av genen av intresse i pcDNA4 / TO tryckt, såsom TR binder till TetO. Sätta doxycyklin till mediet förhindrar T…

Discussion

Transfektion är en allmänt använd protokoll för proteinuttryck och forskning, med många olika varianter för att förbättra uttryck konsistens och stabilitet. Transienta transfektionsreagens erbjuda en enkel, lätt att använda protokoll där cellen och proteinet av intresse kan analyseras inom några timmar till över natten från tiden för transfektion. Tyvärr detta tillvägagångssätt kan vara oförutsägbar när läget av analys kräver en jämn proteinuttryck, såsom enkanaliga inspelningar i elektrofysiol…

Materials

pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler	Esco	n.a
Restriction Enzymes	ThermoScientific Fisher	ER0501
Agarose	Lonza	50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 DNA Ligase	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Bio	A-301-5
Tryptone for microbiology	Merck	6.19305E+13
Yeast Extract	BD worldwide	212750
SIF6000R Incubated Shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin®plasmid	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V Power Supply	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 cell line	Invitrogen	R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Buffer	NEB	B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin	Gibco	10270106
HEPES Buffer Solution (1 M)	Biological Industries	03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)	Biological Industries	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet	ThermoScientific Fisher	51025411
Blasticidine S hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round	Knittel Glass	GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine	Corning	354210
Water, Cell Culture Grade	Biological Industries	03-055-1A
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM ester	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Capsaicin	Tocris	462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope	Olympus	n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher	Sutter Instruments	n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera	QImaging	n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software	Molecular Devices	n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma-Aldrich	276855
P1000 micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
ValveBank perfusion sysytem	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System	Molecular Devices	n.a
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	n.a
pCLAMP 10.6 Software	Molecular Devices	n.a
micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225