Modning af humane stamceller afledt Cardiomyocytter i Biowires Brug af elektrisk stimulering

Summary

Cardiac biowire platform er en in vitro metode, der anvendes til modne humane embryonale og inducerede pluripotente stamcelleafledte cardiomyocytter (hPSC-CM) ved at kombinere dyrkning tredimensionale celle med elektrisk stimulering. Dette håndskrift præsenterer den detaljerede opsætning af hjerte- biowire platformen.

Abstract

Humane pluripotente stamcelleafledte cardiomyocytter (hPSC-CMS) har været en lovende cellekilde og har således tilskyndet undersøgelse af deres potentielle anvendelser i hjerte- forskning, herunder lægemiddelforskning, sygdom modellering, tissue engineering, og regenerativ medicin. Celler fremstillet ved eksisterende protokoller vise en række umodenhed sammenlignet med native voksne ventrikulære cardiomyocytter. Der er gjort mange forsøg på at modne hPSC-CMS med kun moderat modning nået hidtil. Derfor en manipuleret system, kaldet biowire, er blevet udtænkt ved at tilvejebringe både fysiske og elektriske signaler til at lede hPSC-CMS til en mere moden tilstand in vitro. Systemet anvender en mikrofremstillet platform til frø hPSC-CMS i collagen type I gel langs en stiv skabelon sutur til at samle sig på linie hjertevæv (biowire), som underkastes elektrisk felt-stimulering med en gradvis voksende frekvens. Sammenlignet med ikke-stimulerede kontroller,stimulerede biowired cardiomyocytter udviser en forøget grad af strukturel og elektrofysiologisk modning. Sådanne ændringer er afhængige af stimulation sats. Dette manuskript beskriver detaljeret design og skabelse af biowires.

Introduction

Celle-baseret behandling er en af ​​de mest lovende og undersøgte strategier for at opnå hjerteopheling / regeneration. Det er blevet hjulpet af hjertevæv teknik og samtidig tilførsel af biomaterialer ^{1, 2.} De fleste tilgængelige celle kilder er blevet undersøgt i dyremodeller for deres potentielt gavnlige virkninger på beskadigede, syge eller ældre hjerter ^3. Især har gjort en betydelig indsats for at anvende human pluripotente stamcelle (hPSC) afledt cardiomyocytter (hPSC-CM), et potentielt ubegrænset autolog celle kilde til hjertevæv engineering. hPSC-CM kan fremstilles under anvendelse af adskillige etablerede protokoller ^{4, 5, 6.} Men de opnåede celler udviser føtale-lignende fænotyper, med en række af umodne egenskaber sammenlignet med voksne ventrikulære cardiomyocytter ^7, </sup> ⁸ . Dette kan være en hindring for anvendelsen af ​​hPSC-CM'er som modeller af voksen hjertevæv i forskning i narkotikaforskning og i udviklingen af ​​voksne hjertesygdomsmodeller ⁹ .

For at overvinde denne begrænsning af fænotypisk umodenhed er nye tilgange blevet undersøgt aktivt for at fremme kardiomyocyt modning. Tidlige studier afslørede effektive formognningsegenskaber i neonatale rottekardiomyocytter via cyklisk mekanisk ¹⁰ eller elektrisk stimulering ¹¹ . Gelkomprimering og cyklisk mekanisk stimulering viste sig også at forbedre nogle aspekter af hPSC-CM modning ^{12 , 13} med minimal forbedring af de elektrofysiologiske og calciumbehandlingsegenskaber. Derfor blev et platformsystem kaldet "biologisk ledning" (biowire) udformet ved at tilvejebringe både strukturelle signaler og elektrisk feltstimuleringn at øge modningen af hPSC-CM'erne ^14. Dette system anvender en mikrofremstillet platform til at skabe linie hjertevæv, der er modtagelig for elektrisk felt-stimulering. Dette kan bruges til at forbedre den strukturelle og elektrofysiologiske løbetid på hPSC-CMS. Her beskriver vi detaljerne i at foretage sådanne biowires.

Protocol

1. Master Design og Fabrication BEMÆRK: Brug blød litografi til enhed fabrikation. Lav en to-lags SU-8 master for polydimethylsiloxan (PDMS) støbning. Design enheden ved hjælp af en design og udarbejdelse software (figur 1A, til venstre). Tegn hvert lag af master separat. Udskrive enheden design på to fotomasker på 20.000 dpi, svarende til de to lag af master 15. Indstille enhedens mønster som gennemsigtige og det omkringliggende omr…

Representative Results

Rationalet for anvendelse af en sutur i biowires er at tjene som en template til dannelse af 3D-konstruktioner, der justeres i én akse og efterligner formen af ​​kardiale fibre. Vi viser, at efter syv dages dyrkning i biowire, celler remodeled gelen omkring suturen (figur 3A). Cellerne samles langs aksen af suturen til dannelse justeret hjertevæv (figur 3). Efter 7 dages forkultur blev biowires underkastet 7 dage af elektrisk felt-stimulering og yd…

Discussion

Dette håndskrift beskriver opsætning og implementering af manipuleret platform, biowire, for at forbedre modning af hPSC-CMS. Indretningen kan fremstilles i standard microfabrication faciliteter, og biowires kan fremstilles med almindelige celledyrkningsteknikker og en elektrisk stimulator.

Så vidt vi ved, er der ingen rapporterede metode, der ligner biowires. Denne strategi afslører, at forbedrede modningsprodukter egenskaber var afhængige af den elektriske stimulation regime, som det …

Materials

L-Ascorbic acid	Sigma	A-4544	hPSC-CM culture media componet
AutoCAD	Autodesk, Inc		Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm			Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail	BD Biosciences	354249	Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I	Sigma	C0130	0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I)	EMD Millipore	260913-25MU	Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm)	Dremel		Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator	Grass	s88x
Fetal bovine serum (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767	Collagen gel component
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES	Sigma	H4034	Collagen gel component
Hot plate	Torrey Pines	HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053
Mask aligner	EVG	EVG 620
Matrigel, growth factor reduced	Corning	354230	Collagen gel component
Medium 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11150059	Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker	VWR	89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14040133
Plate (6-well)	Corning	353046
Plate (6-well), low attachment	Corning	3471
Platinum wires, 0.2 mm			Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Doe & Ingalls Inc.		To develop the wafer
Pouch, peel-open	Convertors	92308	For steam sterilization
Silicon wafer, 4-inch	UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761	Collagen gel component
Sodium hydroxide	Sigma	S8045	Collagen gel component
Sprin coater	Specialty Coating Systems	G3P-8
StemPro-34 culture medium	Thermo Fisher Scientific	10639011	hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media			Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50	MicroChem Corp.		photoresist, master component
SU-8 2050	MicroChem Corp.		photoresist, master component
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25%	Thermo Fisher Scientific	25200056	hPSC-CM culture media componet
Wash medium			IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin