इलेक्ट्रिकल उत्तेजना का उपयोग करने वाले बायोवायर में मानव स्टेम कोशिका-व्युत्पन्न कार्डिय्योमायसाइट्स का परिपक्वता
Summary
हृदय biowire मंच एक इन विट्रो बिजली की उत्तेजना के साथ तीन आयामी सेल खेती के संयोजन के द्वारा मानव भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocytes (hPSC-मुख्यमंत्री) परिपक्व करने के लिए इस्तेमाल किया विधि है। यह पांडुलिपि हृदय biowire मंच की विस्तृत सेटअप प्रस्तुत करता है।
Abstract
मानव pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocytes (hPSC मुख्यमंत्रियों) एक होनहार सेल स्रोत रहे हैं और इस प्रकार हृदय अनुसंधान के क्षेत्र में अपनी क्षमता अनुप्रयोगों, दवाओं की खोज, रोग मॉडलिंग, ऊतक इंजीनियरिंग, और पुनर्योजी चिकित्सा सहित की जांच प्रोत्साहित किया है। हालांकि, मौजूदा प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित कोशिकाओं देशी वयस्क निलय cardiomyocytes के साथ तुलना में अपरिपक्वता की एक श्रृंखला प्रदर्शित करते हैं। कई प्रयासों hPSC मुख्यमंत्रियों को परिपक्व होने में, केवल मध्यम अब तक प्राप्त कर ली परिपक्वता के साथ बनाया गया है। इसलिए, एक इंजीनियर प्रणाली, biowire कहा जाता है, इन विट्रो में एक अधिक परिपक्व अवस्था में hPSC मुख्यमंत्रियों नेतृत्व करने के लिए दोनों शारीरिक और बिजली के संकेत उपलब्ध कराने के द्वारा तैयार किया गया है। प्रणाली कोलेजन प्रकार मैं एक कठोर टेम्पलेट टांका गठबंधन हृदय ऊतक (biowire), जो एक उत्तरोत्तर बढ़ती आवृत्ति के साथ बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के अधीन है में इकट्ठा करने के लिए अपने साथ जेल में hPSC मुख्यमंत्रियों बीज के एक microfabricated मंच का उपयोग करता है। nonstimulated नियंत्रण की तुलना में,उत्तेजित biowired cardiomyocytes संरचनात्मक और electrophysiological परिपक्वता का एक उन्नत डिग्री दिखा रहे हैं। इस तरह के बदलाव उत्तेजना दर पर निर्भर होते हैं। यह पांडुलिपि डिजाइन और biowires के निर्माण के बारे में विस्तार से वर्णन करता है।
Introduction
सेल आधारित चिकित्सा सबसे होनहार और जांच की रणनीतियों हृदय की मरम्मत / उत्थान को प्राप्त करने से एक है। यह हृदय ऊतक इंजीनियरिंग और biomaterials 1, 2 के सह वितरण द्वारा सहायता प्राप्त किया गया है। अधिकांश उपलब्ध सेल सूत्रों क्षतिग्रस्त, रोगग्रस्त, या आयु वर्ग के दिलों 3 पर उनकी संभावित लाभदायक प्रभाव के लिए पशु मॉडल में अध्ययन किया गया है। विशेष रूप से, महत्वपूर्ण प्रयास मानव pluripotent स्टेम सेल का प्रयोग किया गया है (hPSC) cardiomyocytes (hPSC-मुख्यमंत्री), हृदय ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक संभावित असीमित ऑटोलॉगस सेल स्रोत व्युत्पन्न। hPSC मुख्यमंत्रियों कई स्थापित प्रोटोकॉल 4, 5, 6 का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकता। हालांकि, प्राप्त कोशिकाओं भ्रूण की तरह समलक्षणियों, अपरिपक्व विशेषताओं में से एक सीमा के साथ वयस्क निलय cardiomyocytes 7 की तुलना में प्रदर्शित करते हैं, </sup> 8। यह दवाओं की खोज अनुसंधान के क्षेत्र में और वयस्क हृदय रोग मॉडल 9 के विकास में वयस्क हृदय के ऊतकों के मॉडल के रूप में hPSC मुख्यमंत्रियों के आवेदन के लिए एक बाधा हो सकती है।
आदेश प्ररूपी अपरिपक्वता की इस सीमा को पार करने के लिए, नए तरीकों को सक्रिय रूप से cardiomyocyte परिपक्वता को बढ़ावा देने के जांच की गई है। प्रारंभिक अध्ययन चक्रीय यांत्रिक 10 या बिजली की उत्तेजना 11 के माध्यम से नवजात चूहे cardiomyocytes में प्रभावी समर्थक परिपक्वता गुण का पता चला। जेल संघनन और चक्रीय यांत्रिक उत्तेजना भी hPSC-मुख्यमंत्री परिपक्वता 12, 13, electrophysiological और कैल्शियम से निपटने गुणों की कम से कम वृद्धि के साथ के कुछ पहलुओं को बेहतर बनाने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, एक मंच प्रणाली "जैविक तार" (biowire) कहा जाता है दोनों संरचनात्मक संकेतों और बिजली के क्षेत्र stimulatio प्रदान करके तैयार किया गया थाn hPSC मुख्यमंत्रियों 14 वर्ष की परिपक्वता बढ़ाने के लिए। इस प्रणाली गठबंधन हृदय ऊतक कि बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के लिए उत्तरदायी है बनाने के लिए एक microfabricated मंच का उपयोग करता है। यह hPSC मुख्यमंत्रियों के संरचनात्मक और electrophysiological परिपक्वता सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। यहाँ, हम इस तरह के biowires बनाने के विवरण का वर्णन।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पांडुलिपि सेटअप और इंजीनियर मंच, biowire के कार्यान्वयन का वर्णन है, hPSC मुख्यमंत्रियों की परिपक्वता में सुधार होगा। डिवाइस मानक microfabrication सुविधाओं में बनाया जा सकता है, और biowires आम सेल संस्कृति तकनीक और एक बिज?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एक अनुदान सहायता दिल से द्वारा समर्थित किया गया था और स्ट्रोक कनाडा (जी 14-0,006,265) के फाउंडेशन, स्वास्थ्य अनुसंधान (137,352 और 143,066), और एक जेपी बिकेल नींव अनुदान की कनाडा संस्थान से ऑपरेटिंग अनुदान (1,013,821 ) एसएसएन करने के लिए।
Materials
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4-inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
Riferimenti
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