Maturação de cardiomiócitos estaminais humanas derivadas de células em Biowires Usando Electrical Stimulation

Summary

A plataforma biowire cardíaca é um método in vitro utilizado para amadurecer embrionário humano e cardiomiócitos derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas (HPSC-CM) através da combinação de cultura de células tridimensional com estimulação eléctrica. Este manuscrito apresenta a configuração detalhada da plataforma biowire cardíaca.

Abstract

cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (HPSC-CMS) têm sido uma fonte de células promissor e, assim, encorajados a investigação de suas possíveis aplicações na pesquisa cardíaca, incluindo a descoberta de medicamentos, modelagem de doença, a engenharia de tecidos e medicina regenerativa. No entanto, as células produzidas por protocolos existentes exibir uma gama de imaturidade comparado com cardiomiócitos ventriculares adulto nativas. Muitos esforços têm sido feitos para amadurecer HPSC-CMs, com apenas maturação moderada alcançado até agora. Portanto, um sistema de engenharia, chamado biowire, foi concebida, fornecendo pistas tanto físicas e eléctricas para levar HPSC-MC para um estado mais maduro in vitro. O sistema utiliza uma plataforma microfabricado para semear HPSC-CMs em colagénio do tipo I gel ao longo de um fio de sutura molde rígido para montar em tecido cardíaco alinhados (biowire), que é submetido a estimulação do campo eléctrico com uma frequência progressivamente crescente. Em comparação com os controlos não estimulados,estimulada biowired cardiomiócitos exibem um maior grau de maturação estrutural e electrofisiológica. Tais alterações são dependentes da taxa de estimulação. Este manuscrito descreve em detalhe a concepção e criação de biowires.

Introduction

terapia baseada em celular é uma das mais promissoras e investigados para alcançar cardíaca reparação / regeneração. Ele foi auxiliado por engenharia de tecidos cardíaco e o co-entrega de biomateriais ^{1, 2.} A maioria das fontes celulares disponíveis têm sido estudados em modelos animais para os seus efeitos potencialmente benéficos sobre danificados, doentes, ou corações com idades entre ^3. Em particular, os esforços significativos foram feitos para usar células-tronco pluripotentes humanas (HPSC) derivada de cardiomiócitos (HPSC-CM), uma fonte de células autólogas potencialmente ilimitado para a engenharia de tecido cardíaco. HPSC-CMs pode ser produzido usando vários protocolos estabelecidos ^{4, 5, 6.} No entanto, as células obtidas a exibir os fenótipos fetais semelhante, com uma gama de características imaturas em comparação com cardiomiócitos ventriculares do adulto ^7, </sup> ^8. Isso pode ser um obstáculo para a aplicação de HPSC-CMs como modelos de tecido cardíaco de adultos na pesquisa de descoberta de drogas e no desenvolvimento de adultos modelos de doenças cardíacas ^9.

De modo a ultrapassar esta limitação de imaturidade fenotípica, novas abordagens têm sido investigado activamente para promover a maturação de cardiomiócitos. Os primeiros estudos revelaram propriedades pró-maturação eficazes em cardiomiócitos de ratos neonatais através cíclico mecânico ¹⁰ ou estimulação eléctrica ^11. Compactação do gel e estimulação mecânica cíclico também foram exibidas para melhorar alguns aspectos da HPSC-CM maturação ^{12, 13,} com realce mínimo das propriedades de manuseamento electrofisiológicos e de cálcio. Portanto, um sistema de plataforma chamado "fio biológica" (biowire) foi concebido, fornecendo ambas as pistas estruturais e estimulação do campo eléctricon para melhorar a maturação de HPSC-CMs ^14. Este sistema utiliza uma plataforma microfabricado para criar tecido cardíaco alinhados que é passível de estimulação do campo eléctrico. Isso pode ser usado para melhorar a maturidade estrutural e eletrofisiológica da HPSC-CMS. Aqui, descrevemos os detalhes de fazer tais biowires.

Protocol

1. Projeto mestre e fabricação NOTA: Use litografia suave para a fabricação do dispositivo. Faça um mestre SU-8 de duas camadas para a moldagem de polidimetilsiloxano (PDMS). Desenhe o dispositivo usando um software de desenho e desenho ( Figura 1A , à esquerda). Desenhe cada camada do mestre separadamente. Imprima o desenho do dispositivo em duas fotomassagens a 20.000 dpi, correspondendo às duas camadas do mestre 15 . Definir o pad…

Representative Results

O racional para o uso de uma sutura no biowires é servir como um molde para a formação de construções 3D que se alinham em um eixo e imitam a forma de fibras cardíacas. Mostramos que após sete dias de cultura no biowire, as células remodelaram o gel ao redor da sutura ( Figura 3A ). As células foram montadas ao longo do eixo da sutura para formar o tecido cardíaco alinhado ( Figura 3 ). Após 7 dias de pré-cultura, os biowires foram submetidos…

Discussion

Este manuscrito descreve a configuração e a implementação da plataforma de engenharia, biowire, para melhorar a maturao de HPSC-CMs. O dispositivo pode ser feito em instalações de microfabricação padrão, e biowires pode ser produzido com técnicas de cultura de células comuns e um estimulador elétrico.

Para nosso conhecimento, não há nenhum método relatado semelhante ao biowires. Esta estratégia revela que a melhoria das propriedades de maturação foram dependentes do regime …

Materials

L-Ascorbic acid	Sigma	A-4544	hPSC-CM culture media componet
AutoCAD	Autodesk, Inc		Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm			Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail	BD Biosciences	354249	Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I	Sigma	C0130	0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I)	EMD Millipore	260913-25MU	Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm)	Dremel		Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator	Grass	s88x
Fetal bovine serum (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767	Collagen gel component
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES	Sigma	H4034	Collagen gel component
Hot plate	Torrey Pines	HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053
Mask aligner	EVG	EVG 620
Matrigel, growth factor reduced	Corning	354230	Collagen gel component
Medium 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11150059	Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker	VWR	89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14040133
Plate (6-well)	Corning	353046
Plate (6-well), low attachment	Corning	3471
Platinum wires, 0.2 mm			Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Doe & Ingalls Inc.		To develop the wafer
Pouch, peel-open	Convertors	92308	For steam sterilization
Silicon wafer, 4-inch	UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761	Collagen gel component
Sodium hydroxide	Sigma	S8045	Collagen gel component
Sprin coater	Specialty Coating Systems	G3P-8
StemPro-34 culture medium	Thermo Fisher Scientific	10639011	hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media			Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50	MicroChem Corp.		photoresist, master component
SU-8 2050	MicroChem Corp.		photoresist, master component
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25%	Thermo Fisher Scientific	25200056	hPSC-CM culture media componet
Wash medium			IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin