La maduración de madre humanas cardiomiocitos derivado de células en Biowires uso de la estimulación eléctrica

Summary

La plataforma biowire cardiaca es un método in vitro utilizado para madurar embrionario humano y los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (HPSC-CM) combinando el cultivo de células en tres dimensiones con la estimulación eléctrica. Este manuscrito presenta la configuración detallada de la plataforma biowire cardíaco.

Abstract

Los cardiomocitos derivados de células madre pluripotenciales humanas (hPSC-CMs) han sido una fuente prometedora de células y por lo tanto han fomentado la investigación de sus aplicaciones potenciales en la investigación cardíaca, incluyendo el descubrimiento de fármacos, modelación de enfermedades, ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Sin embargo, las células producidas por los protocolos existentes muestran un rango de inmadurez en comparación con los cardiomiocitos ventriculares adultos nativos. Se han hecho muchos esfuerzos para madurar hPSC-CMs, con sólo maduración moderada alcanzada hasta el momento. Por lo tanto, se ha ideado un sistema de ingeniería, llamado biowire, proporcionando señales tanto físicas como eléctricas para conducir los hPSC-CM a un estado más maduro in vitro . El sistema utiliza una plataforma microfabricada para sembrar hPSC-CMs en gel de colágeno tipo I a lo largo de una sutura moldeada rígida para ensamblar en tejido cardiaco alineado (biowire), que es sometido a estimulación de campo eléctrico con una frecuencia progresivamente creciente. En comparación con los controles no estimulados,estimularon biowired cardiomiocitos exhiben un grado mejorado de maduración estructural y electrofisiológico. Tales cambios son dependientes de la velocidad de estimulación. Este manuscrito describe en detalle el diseño y creación de biowires.

Introduction

terapia basada en células es una de las estrategias más prometedoras e investigados para lograr la reparación cardíaca / regeneración. Se ha ayudado por la ingeniería de tejidos cardíaco y el co-suministro de biomateriales ^{1, 2.} La mayoría de las fuentes de células disponibles se han estudiado en modelos animales por sus efectos potencialmente beneficiosos sobre dañadas o envejecidas corazones enfermos ^3. En particular, se han hecho esfuerzos significativos para utilizar células madre pluripotentes humana (HPSC) derivada de los cardiomiocitos (HPSC-CM), una fuente de células autólogas potencialmente ilimitado para la ingeniería de tejido cardíaco. HPSC-CM puede producirse usando varios protocolos establecidos ^{4, 5, 6.} Sin embargo, las células obtenidas muestran fenotipos fetales similar, con una gama de características inmaduras en comparación con los cardiomiocitos ventriculares adultos ^7, </sup> ^8. Esto puede ser un obstáculo para la aplicación de HPSC-CM como modelos de tejido cardiaco de adultos en la investigación y el descubrimiento de fármacos en el desarrollo de modelos de enfermedades cardiacas adultas ^9.

Con el fin de superar esta limitación de inmadurez fenotípica, nuevos enfoques se han investigado activamente para promover la maduración de los cardiomiocitos. Los primeros estudios revelaron propiedades pro-maduración eficaces en cardiomiocitos de rata neonatal a través cíclico mecánico ¹⁰ o la estimulación eléctrica ^11. Compactación Gel y la estimulación mecánica cíclica también se mostró a mejorar algunos aspectos de la maduración HPSC-CM ^{12, 13,} con la mejora mínima de las propiedades de manipulación electrofisiológicos y de calcio. Por lo tanto, un sistema de plataforma llamada "alambre biológica" (biowire) fue ideado por proporcionar ambas claves estructurales y estimulación del campo eléctricon para mejorar la maduración de HPSC-CM ^14. Este sistema utiliza una plataforma microfabricado para crear tejido cardíaco alineados que es susceptible a la estimulación de campo eléctrico. Esto se puede utilizar para mejorar la madurez estructural y electrofisiológica de HPSC-CM. A continuación, describimos los detalles de fabricación de tales biowires.

Protocol

1. Diseño principal y Fabricación NOTA: El uso de litografía blanda para la fabricación del dispositivo. Hacer una de dos capas SU-8 maestro para polidimetilsiloxano de moldeo (PDMS). Diseñar el dispositivo mediante un diseño y elaboración de software (Figura 1A, izquierda). Dibuje cada capa del maestro por separado. Imprimir el diseño del dispositivo en dos fotomáscaras en 20.000 dpi, correspondiente a las dos capas del maestro 15.</sup…

Representative Results

El racional para el uso de una sutura en las biowires es servir como una plantilla para la formación de constructos 3D que se alinean en un eje y imitan la forma de fibras cardíacas. Se demuestra que después de siete días de cultivo en el biowire, las células remodelado el gel alrededor de la sutura (Figura 3A). Las células montadas a lo largo del eje de la sutura para formar alineados tejido cardíaco (Figura 3). Después de 7 días de precultivo,…

Discussion

Este manuscrito describe la configuración e implementación de la plataforma de ingeniería, biowire, para mejorar la maduración de HPSC-CM. El dispositivo se puede realizar en instalaciones de microfabricación estándar, y biowires puede ser producido con técnicas de cultivo celular comunes y un estimulador eléctrico.

Hasta donde sabemos, no existe un método similar al reportado biowires. Esta estrategia revela que la mejora de las propiedades de maduración eran dependientes de la pa…

Materials

L-Ascorbic acid	Sigma	A-4544	hPSC-CM culture media componet
AutoCAD	Autodesk, Inc		Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm			Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail	BD Biosciences	354249	Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I	Sigma	C0130	0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I)	EMD Millipore	260913-25MU	Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm)	Dremel		Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator	Grass	s88x
Fetal bovine serum (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767	Collagen gel component
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES	Sigma	H4034	Collagen gel component
Hot plate	Torrey Pines	HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053
Mask aligner	EVG	EVG 620
Matrigel, growth factor reduced	Corning	354230	Collagen gel component
Medium 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11150059	Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker	VWR	89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14040133
Plate (6-well)	Corning	353046
Plate (6-well), low attachment	Corning	3471
Platinum wires, 0.2 mm			Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Doe & Ingalls Inc.		To develop the wafer
Pouch, peel-open	Convertors	92308	For steam sterilization
Silicon wafer, 4-inch	UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761	Collagen gel component
Sodium hydroxide	Sigma	S8045	Collagen gel component
Sprin coater	Specialty Coating Systems	G3P-8
StemPro-34 culture medium	Thermo Fisher Scientific	10639011	hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media			Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50	MicroChem Corp.		photoresist, master component
SU-8 2050	MicroChem Corp.		photoresist, master component
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25%	Thermo Fisher Scientific	25200056	hPSC-CM culture media componet
Wash medium			IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin