Mognad av mänskliga stamceller som härrör Cardiomyocytes i Biowires Använda elektrisk stimulering

Summary

Hjärt biowire plattformen är en in vitro-metod som används för att mogna humana embryonala och inducerade pluripotenta stamceller härledda kardiomyocyter (hPSC-CM) genom att kombinera tredimensionella cellodlingar med elektrisk stimulering. Detta manuskript presenterar detaljerade installationen av hjärt biowire plattformen.

Abstract

Humana pluripotenta stamceller härledda kardiomyocyter (hPSC-CMS) har varit ett lovande cellkälla och har därmed uppmuntrat undersökning av deras potentiella tillämpningar inom hjärt forskning, inklusive läkemedelsupptäckt, sjukdom modellering, vävnadsteknik, och regenerativ medicin. Emellertid celler som produceras av existerande protokoll visa ett intervall av omognad jämfört med nativa vuxen ventrikulära kardiomyocyter. Många ansträngningar har gjorts för att mogna hPSC-CMS med endast måttlig mognad uppnås hittills. Därför konstruerad systemet, kallat biowire, varit har utarbetat genom att tillhandahålla både fysiska och elektriska signaler till bly hPSC-CM till en mer mogen tillstånd in vitro. Systemet använder en mikrofabricerad plattform till utsäde hPSC-CMs i kollagen typ I gela längs en styv mall sutur för att montera in i linje hjärtvävnaden (biowire), som utsattes för elektriska fältstimulering med en progressivt ökande frekvens. Jämfört med icke stimulerade kontrollerstimulerade biowired kardiomyocyter uppvisar en ökad grad av strukturell och elektrofysiologiska mognad. Sådana förändringar är beroende av stimuleringsfrekvensen. Detta manuskript beskriver i detalj design och skapande av biowires.

Introduction

Cellbaserad terapi är en av de mest lovande och undersökta strategier för att uppnå hjärt reparation / regeneration. Det har med hjälp av hjärtvävnadsteknik och co-leverans av biomaterial ^{1, 2.} De flesta tillgängliga cellkällor har studerats i djurmodeller för deras potentiellt positiva effekter på skadade, sjuka eller äldre hjärtan ^3. I synnerhet, har stora ansträngningar gjorts för att använda human pluripotent stamcell (hPSC) -härledda kardiomyocyter (hPSC-CM), en potentiellt obegränsad autolog cellkälla för hjärtvävnadsteknik. hPSC-CMs kan produceras med användning av flera fastställda protokoll ^{4, 5, 6.} Emellertid, de erhållna cellerna uppvisar fetala liknande fenotyper, med en rad av omogna egenskaper jämfört med vuxna ventrikulära kardiomyocyter ^7, </sup> ^8. Detta kan vara ett hinder för tillämpningen av hPSC-CM som modeller för vuxna hjärtvävnad i läkemedelsforskning och utveckling av vuxna förebilder ⁹ hjärtsjukdom.

För att övervinna denna begränsning av fenotypisk omognad, har nya metoder aktivt undersökts för att främja cardiomyocyte mognad. Tidiga studier avslöjade effektiva pro-mognads egenskaper i neonatala råttkardiomyocyter via cyklisk mekanisk ¹⁰ eller elektrisk stimulering ^11. Gel kompaktering och cyklisk mekanisk stimulering visade sig också förbättra vissa aspekter av hPSC-CM mognad ^{12, 13,} med minimal ökning av hanterings de elektrofysiologiska och kalcium egenskaper. Därför var en plattform system som kallas "biologisk tråd" (biowire) devised genom att tillhandahålla både strukturella signaler och elektriska fältet stimuleringn för att förbättra mognaden av hPSC-CM ^14. Detta system använder en mikro plattform för att skapa linje hjärtvävnad som är mottaglig för elektrisk fältstimulering. Detta kan användas för att förbättra den strukturella och elektrofysiologiska löptid hPSC-cm. Här beskriver vi detaljerna i att göra sådana biowires.

Protocol

1. Master Design och Fabrication OBS! Använd mjuk litografi för tillverkning av apparater. Gör en tvåskikt SU-8-mast för polydimetylsiloxan (PDMS) gjutning. Konstruera enheten med hjälp av en design- och ritningsprogramvara ( Figur 1A , vänster). Rita varje lager av masten separat. Skriv ut designen på två fotomasker vid 20 000 dpi, vilket motsvarar de två skikten i master 15 . Ställ in enhetsmönstret så transparent och omgivni…

Representative Results

Det rationella för användningen av en sutur i biowires är att fungera som ett templat för bildande av 3D-konstruktioner som är inriktade i en axel och efterliknar formen av hjärtfibrer. Vi visar att efter sju dagars odling i biowire, celler ombyggda gelén runt suturen (Figur 3A). Cellerna monterade längs axeln av suturen för att bilda linje hjärtvävnad (Figur 3). Efter 7 dagar av förodling ades biowires kastades 7 dagar av elektrisk fältstim…

Discussion

Detta manuskript beskriver installationen och genomförandet av den modifierade plattformen biowire att förbättra mognaden av hPSC-cm. Anordningen kan tillverkas i standardmikrotillverkningsmöjligheter och biowires kan produceras med vanliga cellodlingstekniker och en elektrisk stimulator.

Så vitt vi vet finns det ingen rapporterad metod som liknar biowires. Denna strategi visar att förbättrade mognads egenskaper var beroende av den elektriska stimuleringen regim, vilket framgår av de…

Materials

L-Ascorbic acid	Sigma	A-4544	hPSC-CM culture media componet
AutoCAD	Autodesk, Inc		Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm			Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail	BD Biosciences	354249	Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I	Sigma	C0130	0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I)	EMD Millipore	260913-25MU	Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm)	Dremel		Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator	Grass	s88x
Fetal bovine serum (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767	Collagen gel component
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES	Sigma	H4034	Collagen gel component
Hot plate	Torrey Pines	HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053
Mask aligner	EVG	EVG 620
Matrigel, growth factor reduced	Corning	354230	Collagen gel component
Medium 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11150059	Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker	VWR	89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14040133
Plate (6-well)	Corning	353046
Plate (6-well), low attachment	Corning	3471
Platinum wires, 0.2 mm			Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Doe & Ingalls Inc.		To develop the wafer
Pouch, peel-open	Convertors	92308	For steam sterilization
Silicon wafer, 4-inch	UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761	Collagen gel component
Sodium hydroxide	Sigma	S8045	Collagen gel component
Sprin coater	Specialty Coating Systems	G3P-8
StemPro-34 culture medium	Thermo Fisher Scientific	10639011	hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media			Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50	MicroChem Corp.		photoresist, master component
SU-8 2050	MicroChem Corp.		photoresist, master component
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25%	Thermo Fisher Scientific	25200056	hPSC-CM culture media componet
Wash medium			IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin