एक विरोधी TNF मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) के सापेक्ष शक्ति का निर्धारण TNF द्वारा एक इन विट्रो विश्लेषणात्मक विधि का उपयोग कर बेअसर
Summary
WEHI १६४ कोशिकाओं के साथ एक बेअसर तंत्र का उपयोग कर एक विरोधी TNFα मॉब के सापेक्ष विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि के निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया है । इस प्रोटोकॉल एक ही जैविक कार्यशीलता के साथ विभिंन अणुओं की बेअसर ताकत की तुलना के लिए उपयोगी है ।
Abstract
यह प्रोटोकॉल किसी एंटी-TNFα मॉब का उपयोग करके माउस fibroblast सेल मॉडल (WEHI १६४) में TNFα की अपोप्तोटिक गतिविधि की माप को दिखाता है । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य anti-TNFα अणुओं जैसे फ्यूजन प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है । सेलुलर मॉडल यहां कार्यरत TNFα-मध्यस्थता apoptosis के प्रति संवेदनशील है जब एक अतिरिक्त तनाव कारक सेल संस्कृति की स्थिति (जैसे, सीरम अभाव) में प्रेरित है । इस प्रक्रिया मिसाल कैसे इस विश्लेषणात्मक परख निष्पादित करने के लिए, कुंजी नमूना तैयारी, सेल कमजोर पड़ने, apoptosis प्रेरण, और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माप है कि सफल परिणाम सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है से संबंधित आपरेशनों पर प्रकाश डाला । इस प्रोटोकॉल apoptosis प्रेरण और कुशल संकेत रिकॉर्डिंग से संबंधित सबसे अच्छा प्रदर्शन की स्थिति का पता चलता है, कम अनिश्चितता मूल्यों के लिए अग्रणी ।
Introduction
जैविक शक्ति परख उत्पाद विशेषताओं है कि प्रासंगिक जैविक गुणों से जुड़े हुए है के आधार पर जैविक गतिविधि के मात्रात्मक उपाय है, मात्रा (मास में व्यक्त), जबकि प्रोटीन सामग्री का एक भौतिक उपाय है । शक्ति परीक्षण, अंय विश्लेषणात्मक तरीके के साथ साथ, उत्पाद अनुरूप, स्थिरता, और तुलनात्मक अध्ययन के भाग के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं । इस अर्थ में, शक्ति मापन के लिए प्रदर्शित किया जाता है कि उत्पाद बैचों महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषताओं (CQAs) या नैदानिक परीक्षणों के बाद और बाजार की मंजूरी के बाद सभी चरणों के दौरान स्वीकृति मानदंड को पूरा ।
Apoptosis कोशिका मृत्यु क्रमादेशित है, स्वाभाविक रूप से जब कोशिकाओं को एक वायरस से संक्रमित है या जब कोशिकाओं को एक पर्यावरणीय कारक है कि सेलुलर व्यवहार्यता और समारोह1,2समझौता से बल दिया जाता है । दूसरों के अलावा, apoptosis अवरोध, या जैविक बेअसर, मुख्य रूप से mAbs के चिकित्सकीय तंत्र ज्ञात में से एक है, विशेष रूप से पुराने रोगों के उपचार में, प्रतिरक्षा मध्यस्थता भड़काऊ विकारों के रूप में. विरोधी TNFα अणुओं p55 और p75 सेल सतह रिसेप्टर्स3के साथ ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα) की बातचीत को अवरुद्ध द्वारा उनके चिकित्सीय गुणों डालती है, इस प्रकार के अंत में सेलुलर apoptosis के लिए नेतृत्व के संकेत रास्ते को रोकने.
TNFα कुछ पुरानी बीमारियों में सूजन का उत्पादन कर सकते हैं4. TNFα मैक्रोफेज द्वारा extracellular वातावरण में स्रावित spuriously है, जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के संतरियों होते हैं और इस प्रकार के रोग में मुख्य अभिनेताओं को५. एक आम रास्ते के रूप में, TNFα इन बीमारियों के रोगजनन के साथ जुड़ा हुआ है । नियंत्रण के बिना और लगातार प्रेरण और सेल तनाव के तहत, TNFα कोशिका मृत्यु और ऊतक अध कि पतन, अंततः रुमेटी गठिया, Crohn रोग, और अंय रोग प्रोफाइल6के लिए अग्रणी लाती है ।
TNF विरोधी कि TNF और इसकी रिसेप्टर्स के बीच बातचीत को ब्लॉक तेजी से लक्षण को कम करने और इन रोगों की प्रगति में बाधा के लिए एक प्रभावी चिकित्सा के रूप में इस्तेमाल किया गया है. आजकल, विरोधी TNFα दवा उत्पादों को व्यापक रूप से इस cytokine की प्रणालीगत एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है, इस प्रकार शामिल ऊतकों के आगे अध कि रोक । इस अर्थ में, एक प्रतिलिपि और मजबूत करने के लिए अपने जैविक प्रभाव को प्राप्त करने के लिए एक दवा की विशिष्ट क्षमता का वर्णन परख प्रदान करना अनिवार्य है ।
इस प्रोटोकॉल में, महत्वपूर्ण कदम-एक बेअसर परख के विकास के दौरान की पहचान-जैविक शक्ति के सफल माप के लिए, जैव विश्लेषणात्मक विधि निष्पादित करने के लिए आवश्यक कौशल पर एक विशेष जोर देने के साथ प्रकाश डाला जाता है । इस जैव विश्लेषणात्मक विधि विभिंन बैचों या विरोधी TNFα दवा उत्पादों के बीच उपयोगी तुलना जानकारी जब एक नैदानिक परीक्षण संदर्भ पदार्थ की तुलना में प्रदान करता है ।
Protocol
1. मीडिया और समाधान की तैयारी संस्कृति माध्यम तैयार: RPMI-१६४० के साथ 10% FBS, पीएच ७.४. तैयार परख संस्कृति मध्यम: RPMI-१६४० बिना phenol लाल लेकिन साथ 1% FBS, पीएच ७.४. तैयार सेल वॉश …
Representative Results
Discussion
यह लक्षण वर्णन करने में मदद करता है एक प्राथमिकताओं विकास के तहत एक अणु के जैविक व्यवहार महंगा और समय लेने वाली नैदानिक परीक्षणों से पहले आयोजित की जाती हैं । यह भी एक अनुमोदित दवा उत्पाद के बैच के ल?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम विज्ञान और प्रौद्योगिकी के राष्ट्रीय परिषद (CONACYT), मेक्सिको ग्रांट पी CONACYT २०१५ २२०३३३, अध्ययन के डिजाइन में भाग लेने के बिना द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | — |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | — | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
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