إعداد كروموسوم هو ينتشر من الماوس سبيرماتوسيتيس
Summary
الانقسام هو العملية التنموية التي تتشكل الأمشاج من خلال جولة واحدة من تكرار الحمض النووي، وهما جولات متعاقبة من العزل الصبغي. يمكن دراسة الانقسام الاختزالي الثدييات باستخدام تقنية لإعداد هوامش كروموسوم هو. هنا، علينا أن نظهر أسلوب إعداد نواة انتشار السطح من الماوس سبيرماتوسيتيس.
Abstract
الانقسام الاختزالي الثدييات هو عملية دينامية التنمية التي تحدث في الخلايا الجرثومية ويمكن دراستها وتتميز. استخدام أسلوب الانتشار النوى على سطح الشرائح (بدلاً من إفلاتها من ارتفاع)، نبدي أسلوب أمثل على الماوس سبيرماتوسيتيس الذي كان أول من وصف في عام 1997. وتستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع في مختبرات لدراسة الانقسام الاختزالي الثدييات نظراً لأنه ينتج عدد كبير أنوية ذات جودة عالية تمر بالمراحل الفرعية للطور الأول “سيمينيفيروس أولاً” الأنابيب وتوضع أولاً في محلول ناقص التوتر إلى تضخم سبيرماتوسيتيس. ثم يتم إطلاق سبيرماتوسيتيس في حل سكروز لإنشاء تعليق خلية، وتنتشر الأنوية على الشرائح الزجاجية مثبت بالدماء. وعقب إيمونوستينينج، يمكن دراسة مجموعة متنوعة بروتينات ذات صلة وثيقة بالعمليات هو. على سبيل المثال، يمكن بسهولة تصور بروتينات المجمع سينابتونيمال، وهيكل ثلاثي الذي يربط بين المحاور/النوى كروموسوم من هومولوجس معا. هو جزئ البروتينات، التي تشارك في إصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل قبل اقترانها مثلى، يمكن أيضا أن تكون إيمونوستينيد لتقييم تطور الطور الأول أنا. هنا يمكننا وصف وتبين بالتفصيل أسلوب يستخدم على نطاق واسع لدراسة الانقسام الاختزالي الثدييات في سبيرماتوسيتيس من الفئران الذكور الأحداث أو الكبار.
Introduction
الفئران تستخدم على نطاق واسع ككائن نموذج لدراسة الانقسام الاختزالي في الثدييات. ويمكن تقييم كل العمليات التنموية العادية والعيوب التي تحدث أثناء الانقسام الاختزالي. يمكن وصف الجدول الزمني وتطور السمات البارزة التي تحدث أثناء الطور الأول والمراحل الفرعية، فضلا عن عدد وافر من البروتينات المحددة المشاركة في العمليات الحاسمة للتنظيم للانقسام في نوع البرية والفئران المسخ. العديد من العمليات المتخصصة التي تحدث خلال الانقسام الاختزالي درست بالتفصيل (استعرض في هاندل وشيمينتي1). وتشمل هذه الحمض النووي كسر مزدوج-ستراند (جهاز تسوية المنازعات) تشكيل وإصلاح وممارسو وتشكيل مجمع سينابتونيمال والعزل الصبغي.
أحد جوانب هامة لدراسة العمليات هو هو القدرة على دراسة الأنوية تحتوي على الكروموزومات المتماثلة التي يتم حلها بشكل مرئي وبصريا على نحو أفضل التمييز وتحديد المراحل الفرعية للطور الأول “الطور الأول أولاً” أنا تتألف من المراحل الفرعية 5 التي تتسم بسمات محددة، بما في ذلك تشكيل مجمع سينابتونيمال (SC). اتفاقية استكهولم هي سقالة البروتين الثلاثية التي تمكن من المزاوجة وإصلاح كسر مزدوج-حبلا الحمض النووي من هومولوجس. أثناء ليبتونيما، محاذاة homologs كما تحدد العناصر المحورية لاتفاقية استكهولم. ثم إرفاق العناصر المركزية للمجمع سينابتونيمال أثناء زيجونيما يسهل اتصال الأقران والمادية (تشابك) بين أزواج من هومولوجس. أثناء باتشينيما، يصبح تشابك homologs كاملة ويتم تشكيل الحمض النووي عمليات الانتقال من إصلاح للسكان تحديد فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي عن طريق جزئ مثلى. يفكك اتفاقية استكهولم خلال ديبلونيما، مما يتيح هومولوجس ديسينابسي ولكن لا تزال تعلق بها centromeres ومواقع لعمليات الانتقال الحمض النووي. وأخيراً أثناء دياكينيسيس، هومولوجس ريكوندينسي، ويحدث الانتقال إلى الطورية1.
تاريخيا، نشر سطح من الكروماتين هو أسفرت عن الأنوية القليلة، وبخاصة من المراحل المبكرة من الطور الأول أنا2. نتيجة لذلك تم تعديل هذه الأساليب لتحسين فصل الخلايا من الأنسجة (الخصية أو المبيض)، وهذا أسلوب الكروماتين هو نشر، وغلة عالية الجودة هو نواة للتقييم2،3، 4-وبالإضافة إلى ذلك، أثبت هذا الأسلوب أن يكون مفيداً في الحفاظ على النووي وملزمة الكروماتين البروتينات في نواة هو كما يتضح من إيمونولوكاليزيشن نشر تقنيات5،،من67. ولذلك، الأسلوب في البداية وصف بيترز2 وأثبت هنا غلة العديد من الأنوية spermatocyte انفجر منفصلة تحتوي على هومولوجس تمر المراحل الفرعية leptotene، زيجوتيني، باتشيتيني، وطور، ودياكينيسيس من الطور الأول أنا.
تقنية إعداد سطح الانتشار النوى (تسمى أيضا تحليل انتشار الكروماتين) يستخدم على نطاق واسع لدراسة الانقسام الاختزالي في ميادين البيولوجيا الإنجابية والخلية. الشرائح التي تحتوي على نويات السطح-انتشار يمكن فيما بعد إيمونوستينيد مع الأجسام المضادة للبروتينات ذات الاهتمام أو تعرض لتلطيخ الفضة، وتحليلها ثم مع الفحص المجهري. الأسلوب مشابه للفئران الذكور والإناث على حد سواء، على الرغم من أن التعديلات قد وصفت للفئران الإناث2. من المهم عدم أوفيرمينسي الخصي. الأنوية يجب أيضا جيدا وتنشر ذلك بعد هومولوجس إيمونوستينينج والبروتينات المقترنة يتم رؤيتها بوضوح مع الفحص المجهري. يمكن إعداده في بضع ساعات فقط، وأما إيمونوستينيد فورا نويات السطح-انتشار أو المخزنة في-80 درجة مئوية لمدة أقصاها 3 أسابيع قبل ذوبان الجليد وإيمونوستينينج. ومع ذلك، المثلى هي أفضل الحصول على نتائج لبعض البروتينات إذا أجرى immunostaining فورا أو في غضون أسبوعين لإعداد سطح الانتشار النوى. شرائح يمكن أن إيمونوستينيد مع بروتوكول قياسي باستخدام الأجسام المضادة للبروتينات ذات الاهتمام، تليها الحضانة مع بروتينات الأجسام المضادة الثانوية مترافق الفلورسنت أو الأصباغ، ثم تصويرها بالأسفار مجهرية8. 15-21 يوم بعد الولادة هناك الأنسجة يكفي كل زوج من النوع المتوحش الخصيتين لإنتاج شرائح 6-10، والفئران الأكبر سنا (بما في ذلك الكبار) سوف تسفر عن المزيد من الشرائح. ومع ذلك، الفئران البرية نوع 6 أسابيع من العمر وكبار السن أيضا ستسفر عن خلايا أكثر هو ما بعد (أي لوحظت) على الشرائح بعد إيمونوستينينج. وبالإضافة إلى ذلك، جميع المراحل الفرعية للطور الأول أنا يمكن ملاحظتها في الفئران الأحداث والبالغين. الخصيتين من الذكور في الأيام التالية للولادة 10 إلى 15 سوف تسفر عن العديد من أكثر الخلايا leptotene وزيجوتيني. سوف تسفر عن الفئران الأقدم من يوم الولادة 14 إلى 15 نوى باتشيتيني وطور أكثر.
هنا يمكننا وصف وعرض أسلوب يستخدم على نطاق واسع لإعداد نواة انتشار السطح من الماوس سبيرماتوسيتيس.
Protocol
Representative Results
Discussion
للحصول على إعداد كبيرة من نوعية جيدة، وانتشرت أيضا spermatocyte نوى، تشمل الخطوات الأكثر أهمية لهذا البروتوكول وقت الحضانة المناسبة للخصي في عب، مناسبة تنميق للخصي، والتقنية المستخدمة في تنتشر تعليق خلية السكروز slide(s) المغلفة مثبت. نحن احتضان الخصي من الخصيتين للذكور نوع البرية بدءاً من يوم ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب الاعتراف بمساعدة تقنية من أبيغيل هاريس. أنهم أيضا أن نقر كوهين باولا وهولواي كيم للمساعدة على تحسين بروتوكول إعداد نواة انتشار السطح من الماوس سبيرماتوسيتيس. كما نقدر الكتاب قراءة نقدية من المخطوطة التي شندلر كارين.
هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة R01 GM106262 إلى K.M.B.
Materials
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
Riferimenti
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
