Vorbereitung der meiotischen Chromosom erstreckt sich von Maus Spermatozyten
Summary
Meiose ist der Entwicklungsprozess durch den Gameten durch eine einzelne Runde der DNA-Replikation und zwei aufeinanderfolgenden Runden Chromosom Segregation gebildet werden. Säugetier-Meiose kann untersucht werden, durch die Verwendung einer Technik um meiotische Chromosomen breitet sich vorzubereiten. Hier zeigen wir einen Weg der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten.
Abstract
Säugetier-Meiose ist eine dynamische Entwicklungsprozess, der tritt in Keimzellen untersucht und charakterisiert. Mit einer Methode, um Kerne auf der Oberfläche der Folien zu verbreiten (anstatt Fallenlassen aus großer Höhe), zeigen wir eine optimierte Technik, die auf Maus Spermatozyten wurde 1997 erstmals beschrieben. Diese Methode ist weit verbreitet in Laboratorien, Säugetier-Meiose zu studieren, denn es ergibt sich eine Fülle von hochwertigen Kernen unterziehen Subverteiler Prophase I. Seminiferous Röhrchen zuerst befinden sich in eine Hypotonische Lösung Spermatozyten anschwellen. Dann in einer Saccharoselösung erstelle ich eine Zellsuspension Spermatozyten freigesetzt werden, und Kerne verteilen sich auf Fixiermittel getränkten Objektträger. Nach Immunostaining kann eine Vielfalt von Proteinen germane zu meiotische Prozesse untersucht werden. Zum Beispiel können Proteine des synaptonemalen komplexes, eine dreigliedrige Struktur, die das Chromosom Achsen/Kerne der homologen miteinander verbindet einfach visualisiert werden. Meiotischen Rekombination Proteine, die durch homologe Rekombination in der Reparatur von DNA-Doppel-Strangbrüchen beteiligt sind, kann auch Immunostained Fortschreiten der Prophase bewerten ich. Hier wir beschreiben und zeigen im Detail eine Technik weit verbreitet, Säugetier-Meiose in Spermatozyten von Jugendlichen oder erwachsenen männlichen Mäusen zu studieren.
Introduction
Mäuse werden weitgehend als Modellorganismus zur Meiose bei Säugetieren zu studieren. Die normalen Entwicklungsprozesse und Mängel, die während der Meiose auftreten können ausgewertet werden. Die Timeline und Fortschreiten der hervorstechenden Merkmale, die während der Prophase I und Subverteiler auftreten, sowie eine Vielzahl von bestimmten Proteinen, die in Prozessen entscheidend zur Regulierung der Meiose kann bei Wildtyp und Mutanten Mäusen charakterisiert werden. Mehrere spezielle Prozesse, die während der Meiose auftreten, die ich im Detail (rezensiert in Händel und Schimenti1) studiert werden kann. Dazu gehören DNA Double-Strand Break (DSB) Bildung und Reparatur, Rekombination, synaptonemalen Komplex-Bildung und Chromosom Abtrennung.
Ein wichtiger Aspekt des Studiums meiotische Prozesse ist die Fähigkeit, Kerne zu untersuchen, mit homologe Chromosomen, die visuell und optisch besser gelöst werden zu unterscheiden und identifizieren die Subverteiler Prophase I. Prophase ich besteht aus 5 Subverteiler Das zeichnen sich durch Besonderheiten einschließlich der Bildung des synaptonemalen Komplexes (SC). Der SC ist eine dreigliedrige Protein-Gerüst, das ermöglicht die Kopplung und DNA Double-Strand Break Reparatur von homologe. Während Leptonema richten Sie homologe wie axiale Elemente des SC niedergelegt sind. Dann erleichtert die Befestigung der zentralen Elemente des synaptonemalen komplexes während Zygonema Paarung und physische Verbindung (Synapsis) zwischen Paaren von homologen. Während Pachynema Synapsis homologe wird vollständig und DNA-Frequenzweichen werden von der Reparatur einer ausgewählten Population von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch homologe Rekombination gebildet. Der SC zerlegt in Diplonema, so dass homologe zu desynapse, sondern bleiben an ihren Zentromere und an Standorten der DNA Frequenzweichen verbunden. Schließlich während Diakinesis, homologe erneut und die Umstellung auf Metaphase erfolgt in1.
Historisch, Oberfläche-Verbreitung von meiotischen Chromatin ergab einige Kerne, insbesondere von frühen Stadien der Prophase ich2. Infolgedessen wurden diese Methoden geändert, um zu verbessern, die Trennung von Zellen aus dem Gewebe (Hoden oder Eierstöcke), die Technik des sich ausbreitenden meiotische Chromatin und die Ausbeute an qualitativ hochwertigen meiotische Kerne für Auswertung2,3, 4. Darüber hinaus diese Methode erwies sich als nützlich bei der Erhaltung nuklearen und Chromatin Proteine in meiotischen Kerne gebunden, wie veröffentlichten Immunolocalization Techniken5,6,7gezeigt. Daher die Methode zunächst von Peters2 beschrieben und gezeigt hier Erträge viele separate platzen Spermatocyte Kerne enthalten homologe durchläuft die Leptotän, Zygotene, Pachytene, Diplotene und Diakinesis Subverteiler Prophase ich.
Die Technik der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kerne (auch genannt Chromatin Verbreitung Analyse) ist weit verbreitet, Meiose in den Bereichen der Fortpflanzungs- und Zelle Biologie zu studieren. Folien mit Oberfläche verbreitet Kernen können anschließend Immunostained mit Antikörpern gegen interessierender Proteine oder silberne Färbung unterzogen, und dann analysiert werden mit Mikroskopie. Die Methode ist ähnlich bei männlichen und weiblichen Mäusen, obwohl Änderungen für weibliche Mäuse2beschrieben worden sind. Es ist nicht unbedingt seminiferous Röhrchen overmince. Kerne müssen auch gut verteilt, so dass nach Immunostaining homologe und damit verbundenen Proteine sind deutlich mit Mikroskopie zu sehen. Oberfläche-Ausbreitung Kerne können bereit sofort in ein paar Stunden und entweder Immunostained oder bei-80 ° C für maximal 3 Wochen vor dem Auftauen und Immunostaining gespeichert werden. Jedoch werden optimale Ergebnisse für einige Proteine am besten erreicht, wenn Immunostaining sofort oder innerhalb von 2 Wochen der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kernen durchgeführt wird. Folien können sein Immunostained mit einem Standardprotokoll mit Antikörper gegen Proteine des Interesses, gefolgt von Inkubation mit Sekundärantikörper konjugierten, fluoreszierende Proteine oder Farbstoffe, dann mit Fluoreszenz-Mikroskopie8abgebildet. Um postnatale Tag 15-21 Uhr gibt es ausreichend Gewebe pro paar Wildtyp Hoden um 6 bis 10 Folien zu erzielen, und ältere Mäuse (auch Erwachsene) erbringt weitere Folien. Allerdings werden Wildtyp-Mäusen 6 Wochen auch mehr Post-meiotische Zellen (d.h. Spermatids) auf den Folien nach Immunostaining liefern. Darüber hinaus können alle Subverteiler Prophase ich bei Jugendlichen und Erwachsenen Mäusen beobachtet werden. Hoden von männlichen postnatalen Tage 10 bis 15 ergibt viel mehr Leptotän und Zygotene Zellen. Mäuse, die älter als postnatale Tag 14 bis 15 erbringt mehr Pachytene und Diplotene Kerne.
Hier wir beschreiben und zeigen eine weit verbreitete Methode zur Vorbereitung Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um hohe Zahlen der Spermatocyte Kerne gut verteilt, gute Qualität zu erhalten, sind die wichtigsten Schritte dieses Protokolls geeignete Inkubationszeit von seminiferous Röhrchen in HEB, geeignete Zerkleinerung von seminiferous Röhrchen und die Technik eingesetzt, um das Fixativ beschichtete Dias die Saccharose Zellsuspension verteilt sind. Wir inkubieren seminiferous Röhrchen aus Hoden Wildtyp Männchen von postnatale Tag 15 bis zum Erwachsenenalter in HEB für 45 min, während Hoden aus vergleichsweise Alter Ch…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen die technische Unterstützung von Abigail Harris. Sie erkennen auch Paula Cohen und Kim Holloway für die Hilfe, das Protokoll der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten Vorbereitung zu optimieren. Die Autoren schätzen auch kritische Lektüre des Manuskripts von Karen Schindler.
Diese Arbeit wurde von NIH R01 GM106262, K.M.B unterstützt.
Materials
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
Riferimenti
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
