Fare Spermatocytes segregasyonun kromozom hazırlanması yayılır
Summary
Mayoz hangi gamet DNA ikileşmesi bir turu ve kromozom ayrışma birbirini izleyen iki tur üzerinden kurulan gelişimsel işlemidir. Memeli mayoz segregasyonun kromozom yayılır hazırlamak için bir teknik kullanarak incelenebilir. Burada, yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama yöntemi göstermektedir.
Abstract
Memeli mayoz germ hücrelerinde oluşur ve okudu ve karakterize dinamik bir gelişim işlemidir. Çekirdeği üzerinde slaytlar yüzeyine yaymak için bir yöntem kullanarak (onları bir yükseklikten atılan yerine), biz ilk olarak 1997 yılında açıklanmıştır bir en iyi duruma getirilmiş tekniği üzerinde fare spermatocytes göstermek. Bu yöntem yaygın olarak kullanılan yüksek kaliteli çekirdekleri profaz ı. seminifer substages geçiren bir bolluk verimleri çünkü memeli mayoz çalışma laboratuvarlarda tübüllerin ilk spermatocytes şişmeye Hipotonik çözeltilerine yerleştirilir. O zaman spermatocytes bir hücre süspansiyon oluşturmak için bir Sükroz çözümde serbest bırakılır ve çekirdekleri sabitleştirici bulanmış cam slaytlar yayılır. İmmunostaining, proteinler segregasyonun işlemlere konu ile ilgili bir çeşitlilik incelenebilir. Örneğin, protein synaptonemal kompleks kromozom eksen/çekirdek homologs, birlikte bağlayan bir üçlü yapı kolayca görselleştirildiği. DNA çift iplikli kırılmalara tamirde homolog rekombinasyon tarafından söz konusu, segregasyonun rekombinasyon proteinler de profaz ilerlemesini değerlendirmek için immunostained olabilir ben. Burada biz tanımlamak ve ayrıntılı olarak spermatocytes gelen çocuk ya da yetişkin erkek fareler içinde memeli mayoz çalışma için yaygın olarak kullanılan bir tekniği göstermek.
Introduction
Fareler yaygın olarak mayoz memelilerde çalışma için bir model organizma olarak kullanılır. Normal gelişim süreçleri ve mayoz sırasında oluşan hataları değerlendirilebilir. Zaman çizelgesi ve profaz sırasında ben ve substages oluşan belirgin özellikleri ilerlemesini yanı sıra çok sayıda belirli proteinlerin süreçleri mayoz düzenlenmesi için çok önemli yer vahşi türü ve mutasyona uğramış fareler karakterize edilebilir. Ben (Handel ve Schimenti1‘ gözden) ayrıntılı okudu mayoz sırasında oluşan birkaç özel işlemler. Bunlar DNA iki iplikçikli (DSB) formasyonu ve tamir, Rekombinasyon, synaptonemal kompleks oluşumu ve kromozom ayrımı içerir.
Segregasyonun süreçleri eğitimi önemli bir yönü optik ve görsel olarak daha iyi çözümlenir içeren homolog kromozomlar ayırt etmek ve profaz ı. profaz 5 substages oluşur substages tanımlamak çekirdeği incelemek için yeteneğidir Bu synaptonemal kompleksi (SC) oluşumu dahil olmak üzere belirli özellikleri ile karakterizedir. SC bir eşleştirme sağlar üçlü protein iskele ve DNA iki iplikçikli sonu tamiri homologs olduğunu. SC Aksiyel unsurları belirlenmiştir gibi leptonema sırasında homologs hizalayın. O zaman zygonema sırasında synaptonemal kompleks Merkezi elemanları ek eşleştirme ve fiziksel bağlantı (synapsis) homologs çiftleri arasındaki kolaylaştırır. Pachynema sırasında homologs synapsis tam olur ve DNA kesişim üzerinden homolog rekombinasyon DNA çift iplikli kırılmalara select nüfusu tamiri dan oluşur. SC diplonema sırasında homologs desynapse ama onların sentromerler ve DNA kesişim sitelerdeki bağlı kalır izin ayrıştırır. Son olarak homologs diakinesis sırasında recondense ve metafaz geçiş1oluşur.
Tarihsel olarak, yüzey saçan segregasyonun Kromatin, kaç hücre çekirdeği, özellikle de profaz erken dönemlerinde üzerinden vermiştir ben2. Sonuç olarak, bu yöntemleri dokuları (yani testis ya da yumurtalık) hücrelerden ayrılması, Yayilim segregasyonun Kromatin tekniği ve değerlendirme2,3, için yüksek kaliteli segregasyonun çekirdeği verimini artırmak için modifiye edilmiştir 4. buna ek olarak, bu yöntem nükleer koruyarak yararlı kanıtladı ve Kromatin bağlı proteinler segregasyonun çekirdekleri tarafından yayımlanan immunolocalization teknikleri5,6,7gösterildiği gibi. Bu nedenle, bu yöntem başlangıçta Engin2 tarafından açıklanan ve verimleri profaz leptotene, zygotene, pachytene, diplotene ve diakinesis substages geçiren homologs içeren birçok ayrı patlama spermatocyte çekirdeği aşağıda gösterildiği ben.
Yüzey-yayılım çekirdeği (Kromatin yayılmış analiz olarak da bilinir) hazırlama tekniği mayoz üreme ve hücre biyolojisi alanlarında çalışma için yaygın olarak kullanılır. Yüzey-yayılım çekirdek içeren slaytlar immunostained antikorlar proteinlere ilgi ile daha sonra olabilir veya gümüş boyama için tabi ve mikroskobu ile analiz. Yöntem hem erkek hem de dişi fareler için benzer olsa da değişiklikler için dişi fareler2tarif edilmistir. Seminifer tübüllerin overmince değil çok önemlidir. Çekirdeklerin da de immunostaining homologs takip böylece yaymak gerekir ve ilişkili proteinler mikroskobu ile açıkça görülmektedir. Yüzey-yayılım çekirdek sadece birkaç saat ve her iki immunostained hemen hazırlanmış veya en fazla 3 hafta önce çözdürme ve immunostaining-80 ° C’de depolanan. Ancak, en iyi sonuçları en iyi immunostaining hemen veya yüzey-yayılım çekirdeği hazırlama 2 hafta içinde gerçekleştirilirse bazı proteinler için elde edilir. Slaytlar-ebilmek var olmak immunostained karşı antikorlar için faiz, proteinlerin kullanarak standart bir protokol ile kuluçka ikincil antikorlar floresan için konjuge proteinler veya boya ile izledi, sonra Floresans mikroskobu8ile görüntüsü. Doğum sonrası gün 15-21, 6-10 slaytlar vermeye vahşi türü testisler çift başına yeterli doku işte ve büyük fareler (yetişkin dahil) daha fazla slayt verecektir. Ancak, farelerde vahşi tip 6 hafta yaş ve üstü de immunostaining takip slaytlara daha sonrası segregasyonun hücreleri (yani spermatids) ortaya çıkarır. Buna ek olarak, tüm substages profaz, ben çocuk ve yetişkin fareler görülebilmektedir. Testis erkek, doğum sonrası gün 10 ile 15 dan çok daha fazla leptotene ve zygotene hücre ortaya çıkarır. Doğum sonrası gün 14-15 büyük fareler daha fazla pachytene ve diplotene çekirdekleri ortaya çıkarır.
Burada biz tanımlamak ve yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama bir yaygın kullanılan yöntem göstermek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralının en kritik adımlar de yaymak, iyi kalite spermatocyte çekirdek sayısının fazlalığı elde etmek için HEB, seminifer tübüllerin kıyma uygun seminifer tübüllerin uygun kuluçka süresi içerir ve tekniği istihdam Sükroz hücre süspansiyon sabitleştirici kaplamalı slaytları arasında yayıldı. Biz vahşi türü erkeklerin testis dan kıyaslanabilir yaşlı Chtf18iken HEB yetişkinlikte 45 dk için için doğum sonrası gün 15 arasında değişen testislerde tanısal yakla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Abigail Harris teknik yardım kabul. Onlar da Paula Cohen ve Kim Holloway yüzeyine yayılmış çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama Protokolü optimize etmek için yardımcı olduğunuz için kabul. Yazarlar ayrıca el yazması Karen Schindler tarafından eleştirel okuma için teşekkür ederiz.
Bu eser NIH R01 GM106262 için K.M.B. tarafından desteklenmiştir
Materials
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
Riferimenti
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
