Preparazione del cromosoma meiotico si diffonde da Mouse spermatociti
Summary
Meiosi sono il processo di sviluppo da cui i gameti sono formate attraverso un singolo ciclo di replicazione del DNA e due successivi turni di segregazione del cromosoma. Meiosi mammiferi possono essere esaminate utilizzando una tecnica per preparare cromosomici meiotica. Qui, noi dimostrare un metodo di preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse.
Abstract
Meiosi nei mammiferi sono un processo di sviluppo dinamico che si verifica nelle cellule germinali e possa essere studiato e caratterizzato. Utilizzando un metodo per diffondere i nuclei sulla superficie delle diapositive (piuttosto che farli cadere da un’altezza), dimostriamo una tecnica ottimizzata su spermatociti del mouse che è stato descritto nel 1997. Questo metodo è ampiamente usato nei laboratori per lo studio dei mammiferi meiosi perché produce una pletora di nuclei di alta qualità in fase di sottostadi della profase I. seminiferi tubuli si inserisce in una soluzione ipotonica a gonfiarsi spermatociti. Poi spermatociti vengono rilasciati in una soluzione di saccarosio per creare una sospensione cellulare e i nuclei sono sparsi su vetrini imbevuta di fissativo. A seguito di immunostaining, può essere esaminata una diversità delle proteine attinente a processi meiotici. Ad esempio, proteine del complesso synaptonemal, una struttura tripartita che collega i cromosoma assi e nuclei degli omologhi insieme possono essere facilmente visualizzate. Proteine di ricombinazione meiotic, che sono coinvolti nella riparazione di rotture a doppio filamento del DNA tramite la ricombinazione omologa, possono anche essere immunostained per valutare la progressione della Profase I. Qui descriviamo e dimostrare dettagliatamente una tecnica ampiamente utilizzata per lo studio dei mammiferi meiosi in spermatociti da topo maschio giovanile o adulta.
Introduction
Topi sono utilizzati estesamente come organismo modello per lo studio di meiosi nei mammiferi. Possono essere valutati sia i normali processi di sviluppo e difetti che si verificano durante la meiosi. La linea temporale e la progressione delle caratteristiche salienti che si verificano durante la profase I e sottostadi, come pure una moltitudine di specifiche proteine coinvolte in processi cruciali per la regolazione della meiosi può essere caratterizzati in wild type e topi mutanti. Diversi processi specializzati che si verificano durante la meiosi che ho posso essere studiato in dettaglio (rivisto in Handel e Schimenti1). Questi includono la formazione di rotture a doppio filamento (DSB) del DNA e riparazione, ricombinazione, la formazione di Complesso Sinaptonemale e segregazione del cromosoma.
Un aspetto importante di studiare processi meiotici è la capacità di esaminare i nuclei contenenti cromosomi omologhi sono risolti, visivamente e otticamente, per meglio distinguono e identificano i sottostadi della profase I. profase è composto da 5 sottostadi che sono caratterizzati da specifiche caratteristiche tra cui la formazione del complesso synaptonemal (SC). Lo SC è un’impalcatura di proteina tripartita che consente l’accoppiamento e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA degli omologhi. Durante leptonema, omologhi allineare come gli elementi assiali di SC sono fissati. Quindi allegato di elementi centrali del complesso synaptonemal durante zygonema facilita la connessione fisica e accoppiamento (sinapsi) tra coppie di omologhi di. Durante pachynema, sinapsi degli omologhi diventa completo e crossover di DNA sono formate dalla riparazione di una popolazione di seleziona delle rotture del doppio filamento di DNA tramite ricombinazione omologa. La SC Disassembla durante diplonema, permettendo per omologhi di desynapse ma rimangono attaccati ai loro centromeri ed ai luoghi dei crossover di DNA. Infine durante diacinesi, omologhi ricondenseranno e si verifica la transizione alla metafase1.
Storicamente, superficie-diffusione della cromatina meiotica ha reso alcuni nuclei, particolarmente quelle dalle prime fasi della Profase I2. Di conseguenza, questi metodi sono stati modificati per migliorare la separazione delle cellule dai tessuti (cioè testicolo o dell’ovaio), la tecnica di diffusione della cromatina meiotica e la resa dei nuclei meiotic di alta qualità per valutazione2,3, 4. Inoltre, questo metodo si è rivelato utile nel preservare nucleare e cromatina associata proteine nei nuclei meiotici, come dimostrato da immunolocalizzazione pubblicati tecniche5,6,7. Di conseguenza, il metodo inizialmente descritto da Peters2 e dimostrato qui rese molti nuclei di spermatocita scoppio separata contenente gli omologhi che subiscono i sottostadi leptotene, zigotene, pachitene, diplotene e diacinesi della Profase I.
La tecnica della preparazione di superficie-diffusione nuclei (chiamati anche analisi di diffusione della cromatina) è ampiamente usata per lo studio di meiosi nei campi della biologia riproduttiva e cella. Diapositive che contengono i nuclei superficie-diffusione possono essere successivamente immunostained con gli anticorpi alle proteine di interesse o sottoposti a macchiatura d’argento e poi analizzati con microscopia. Il metodo è simile per i topi maschi e femminili, anche se le modifiche sono state descritte per topi femmina2. È fondamentale non overmince tubuli seminiferi. I nuclei devono anche essere ben distribuiti affinché seguendo immunostaining omologhi e proteine associate sono chiaramente visibili con la microscopia. Superficie-diffusione nuclei possono essere preparati in poche ore ed entrambi immunostained immediatamente o conservati a-80 ° C per un massimo di 3 settimane prima di scongelamento e immunostaining. Tuttavia, risultati ottimali si ottengono migliori per alcune proteine se immunostaining viene eseguita immediatamente o entro 2 settimane di preparazione di superficie-diffusione nuclei. I vetrini possono essere immunostained con un protocollo standard usando gli anticorpi alle proteine di interesse, seguita da incubazione con gli anticorpi secondari coniugati a fluorescente proteine o coloranti, allora imaged con microscopia di fluorescenza8. Al giorno postnatale 15-21 c’è tessuto sufficiente per ogni coppia di tipo selvaggio testicoli per produrre 6-10 diapositive e più vecchi topi (compresi gli adulti) produrrà più diapositive. Tuttavia, topi wild type 6 settimane di età ed oltre anche resa più post-meiotiche cellule (cioè spermatidi) sui vetrini seguendo immunostaining. Inoltre, tutti i sottostadi della profase io posso essere osservato in topi giovanili e adulti. Testicoli da maschi a giorni postnatali 10 a 15 produrrà molti più cellule leptotene e zigotene. Topi oltre postnatale giorno 14 a 15 anni di età produrrà più nuclei di pachitene e diplotene.
Qui descriviamo e dimostrare un metodo ampiamente usato della preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per ottenere un numero elevato di nuclei spermatocita ben diffusa, di buona qualità, le fasi più critiche del presente protocollo includono il tempo di incubazione appropriato dei tubuli seminiferi in EB, appropriata macinazione dei tubuli seminiferi, e la tecnica impiegata per si sono diffuse la sospensione cellulare di saccarosio attraverso le diapositive rivestite con fissativa. Noi incubare tubuli seminiferi dai testicoli dei maschi di tipo selvaggio che vanno da postnatale giorno 15 all’età adulta in EB per 45 mi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono l’assistenza tecnica di Abigail Harris. Essi riconoscono anche Paula Cohen e Kim Holloway per aiutare ad ottimizzare il protocollo di preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse. Gli autori hanno anche apprezzano la lettura critica del manoscritto da Karen Schindler.
Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 GM106262 a K.M.B.
Materials
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
Riferimenti
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