Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.
Vurdering af antibiotisk virkning med ny lægemiddeludvikling rettet mod anaerobe bakterier er vanskelig og teknisk krævende. For at få indsigt i mulig MOA kan morfologiske ændringer forbundet med antibiotisk eksponering visualiseres ved hjælp af scanningselektronmikroskopi (SEM). Integration af SEM-billeddannelse med traditionelle killkurver kan forbedre vores indsigt i narkotikahandling og fremme udviklingen af narkotika. For at teste denne forudsætning blev killkurver og SEM-undersøgelser udført ved anvendelse af lægemidler med kendt men forskellig MOA (vancomycin og metronidazol). C. difficile celler (R20291) blev dyrket med eller uden tilstedeværelse af antibiotikum i op til 48 timer. Gennem 48 h intervallet blev cellerne samlet på flere tidspunkter for at bestemme antibiotisk effektivitet og til billeddannelse på SEM. I overensstemmelse med tidligere rapporter havde vancomycin og metronidazol signifikant baktericid aktivitet efter 24 timers behandling målt ved kolonidannende enhed (CFU) landeTing. Ved anvendelse af SEM-billeddannelse fastslog vi, at metronidazol havde signifikante virkninger på cellelængde (> 50% reduktion i cellelængde for hvert antibiotikum, P <0,05) sammenlignet med kontroller og vancomycin. Selvom det fænotypiske respons på lægemiddelbehandling ikke er blevet dokumenteret tidligere på denne måde, er de i overensstemmelse med lægemidlets MOA, der demonstrerer alsidigheden og pålideligheden af billeddannelsen og målingerne og anvendelsen af denne teknik til andre eksperimentelle forbindelser.
Clostridium difficile er en gram positiv, sporeformende bakterie, der forårsager ca. 500.000 infektioner årligt i USA og betragtes som et hot-patogen for trusselsniveau ved Centers for Disease Control and Prevention (CDC), det højeste risikoniveau. 1 Det sidste årti har oplevet betydelig lægemiddeludvikling i antimikrobielle stoffer med aktivitet mod C. difficile . 2 , 3 In vitro- undersøgelser er en nødvendig bestanddel af lægemiddeludviklingsprocessen. 4 Traditionelt anvendes in vitro- følsomheds- og tidsdræbningsstudier til validering af fremtidige dyr og andre in vivo- undersøgelser.
Mens disse metoder tjener en vigtig rolle for evaluering af dræbende handling, opfanger de ikke cellernes fænotypiske respons på farmakologisk behandling. Ved at inkorporere scanningselektronmikroskopi (SEM) med standarD killing kinetiske undersøgelser, er en mere grundig karakterisering af de antibiotiske direkte effekter mulig. 5 , 6 , 7 Her præsenterer vi en metode, hvor SEM anvendes som et middel til profilering af effekten af antibiotikabehandling.
Målet med den nuværende undersøgelse var at skabe en høj-gennemstrømningsmetode til isolering af C. difficile og afprøvning af antibiotikaresistibilitet ved anvendelse af scanningselektronmikroskopi (SEM) som et middel til en mere grundig karakterisering af antibiotikas farmakologiske virkning. Ved hjælp af de her beskrevne protokoller har vi vist, at billeddannelse af cellens fænotypiske respons på antibiotisk behandling kan afsløre indsigt i lægemidlets farmakologiske virkning. Samlet set tager bil…
The authors have nothing to disclose.
These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.
cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
NaCl | Macron | 7532 | |
50mL tubes | Falcon | 352098 | |
Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
yeast extract | Criterion | C741 | |
sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
PBS | Gibco | 10010-031 | |
4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75x25mm |
flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
scanning electron microscope | FEI | XL-30 |