En protokol til at karakterisere de morfologiske ændringer af<em> Clostridium difficile</em> Som svar på antibiotisk behandling

Summary

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Abstract

Vurdering af antibiotisk virkning med ny lægemiddeludvikling rettet mod anaerobe bakterier er vanskelig og teknisk krævende. For at få indsigt i mulig MOA kan morfologiske ændringer forbundet med antibiotisk eksponering visualiseres ved hjælp af scanningselektronmikroskopi (SEM). Integration af SEM-billeddannelse med traditionelle killkurver kan forbedre vores indsigt i narkotikahandling og fremme udviklingen af ​​narkotika. For at teste denne forudsætning blev killkurver og SEM-undersøgelser udført ved anvendelse af lægemidler med kendt men forskellig MOA (vancomycin og metronidazol). C. difficile celler (R20291) blev dyrket med eller uden tilstedeværelse af antibiotikum i op til 48 timer. Gennem 48 h intervallet blev cellerne samlet på flere tidspunkter for at bestemme antibiotisk effektivitet og til billeddannelse på SEM. I overensstemmelse med tidligere rapporter havde vancomycin og metronidazol signifikant baktericid aktivitet efter 24 timers behandling målt ved kolonidannende enhed (CFU) landeTing. Ved anvendelse af SEM-billeddannelse fastslog vi, at metronidazol havde signifikante virkninger på cellelængde (> 50% reduktion i cellelængde for hvert antibiotikum, P <0,05) sammenlignet med kontroller og vancomycin. Selvom det fænotypiske respons på lægemiddelbehandling ikke er blevet dokumenteret tidligere på denne måde, er de i overensstemmelse med lægemidlets MOA, der demonstrerer alsidigheden og pålideligheden af ​​billeddannelsen og målingerne og anvendelsen af ​​denne teknik til andre eksperimentelle forbindelser.

Introduction

Clostridium difficile er en gram positiv, sporeformende bakterie, der forårsager ca. 500.000 infektioner årligt i USA og betragtes som et hot-patogen for trusselsniveau ved Centers for Disease Control and Prevention (CDC), det højeste risikoniveau. ¹ Det sidste årti har oplevet betydelig lægemiddeludvikling i antimikrobielle stoffer med aktivitet mod C. difficile . ^{2 , 3} In vitro- undersøgelser er en nødvendig bestanddel af lægemiddeludviklingsprocessen. ⁴ Traditionelt anvendes in vitro- følsomheds- og tidsdræbningsstudier til validering af fremtidige dyr og andre in vivo- undersøgelser.

Mens disse metoder tjener en vigtig rolle for evaluering af dræbende handling, opfanger de ikke cellernes fænotypiske respons på farmakologisk behandling. Ved at inkorporere scanningselektronmikroskopi (SEM) med standarD killing kinetiske undersøgelser, er en mere grundig karakterisering af de antibiotiske direkte effekter mulig. ^{5 , 6 , 7} Her præsenterer vi en metode, hvor SEM anvendes som et middel til profilering af effekten af ​​antibiotikabehandling.

Protocol

1. Isolering C. difficile fra forskellige miljømæssige eller kliniske kilder Miljøisolater: Skab overfladen af ​​ethvert område af interesse (gulv, dør, håndtag, hylde osv. ) Ved hjælp af en præsteriliseret bomuldsmåler (let fugtet med 0,85% NaCl). 8 Sørg for at bære sterile handsker og placere vatpinden i et steriliseret rør efter færdiggørelsen. Kliniske isolater (afføring): Plad 10 til 100 mg kliniske afføring prøver på cefoxitin-cyc…

Representative Results

Clostridium difficile er en sporeformende bakterie, og det er derfor vigtigt at bestemme morfologiske forskelle mellem vegetative og spore celler forud for enhver funktionel analyse. Figur 1 demonstrerer repræsentative billeder af vegetative celler, der blev fanget under eksponentialfasen af ​​vækstkurven og sporcellerne. Som afbildet er vegetative celler lange, glatte, stangformede strukturer, mens sporer er små, ovale strukturer, der har et groft ydre. …

Discussion

Målet med den nuværende undersøgelse var at skabe en høj-gennemstrømningsmetode til isolering af C. difficile og afprøvning af antibiotikaresistibilitet ved anvendelse af scanningselektronmikroskopi (SEM) som et middel til en mere grundig karakterisering af antibiotikas farmakologiske virkning. Ved hjælp af de her beskrevne protokoller har vi vist, at billeddannelse af cellens fænotypiske respons på antibiotisk behandling kan afsløre indsigt i lægemidlets farmakologiske virkning. Samlet set tager bil…

Materials

cotton gauze	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50mL tubes	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterion	C5141
L-cysteine	Alfa Aesar	A10389
yeast extract	Criterion	C741
sodium taurocholate	Alfa Aesar	A18346
anaerobic chamber	Coy		vinyl anaerobic chamber
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates	Anaerobe systems	AS-213
blood agar plates	Hardy diagnostics	A-10
latex agglutination reagent	Oxoid	DR1107A	C. diff test kit
microcentrifuge tubes	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	50-259-98
microscope slides	J. Melvin freed brand	7525M	75x25mm
flow hood	Labconco	Class II type A2	biosafety cabinet
desk sputtering machine	Denton Vacuum	Desk II
tape	Plastic Core	05072-AB	SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape
gold	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil
scanning electron microscope	FEI	XL-30