Protocolo para Caracterizar los Cambios Morfológicos de<em> Clostridium difficile</em> En respuesta al tratamiento antibiótico

Summary

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Abstract

La evaluación de la acción antibiótica con el desarrollo de nuevos fármacos dirigidos hacia las bacterias anaerobias es difícil y técnicamente exigente. Para obtener información sobre el posible MOA, los cambios morfológicos asociados con la exposición a los antibióticos se pueden visualizar mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). La integración de la imagen de SEM con las curvas de muerte tradicionales puede mejorar nuestra comprensión de la acción de la droga y avanzar en el proceso de desarrollo de fármacos. Para probar esta premisa, las curvas de muerte y los estudios de SEM se llevaron a cabo utilizando fármacos con MOA conocido pero diferente (vancomicina y metronidazol). Las células de C. difficile (R20291) se cultivaron con o sin la presencia de antibiótico hasta 48 h. Durante todo el intervalo de 48 h, las células se recogieron en múltiples puntos de tiempo para determinar la eficacia de los antibióticos y de imágenes en el SEM. De acuerdo con los informes anteriores, vancomicina y metronidazol tuvo una actividad bactericida significativa después de 24 h de tratamiento, medida por la unidad formadora de colonias (UFC)Ting Usando la imagen de SEM se determinó que el metronidazol tuvo efectos significativos sobre la longitud celular (> 50% de reducción en la longitud de la célula para cada antibiótico, P <0,05) en comparación con los controles y la vancomicina. Aunque la respuesta fenotípica al tratamiento farmacológico no se ha documentado previamente de esta manera, son consistentes con el MOA del fármaco demostrando la versatilidad y fiabilidad de la formación de imágenes y las mediciones y la aplicación de esta técnica para otros compuestos experimentales.

Introduction

Clostridium difficile es una bacteria gram-positiva, formadora de esporas, causando aproximadamente 500,000 infecciones anualmente en los Estados Unidos y considerada por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) como el nivel más alto de riesgo. ¹ En la última década se ha observado un considerable desarrollo de fármacos en antimicrobianos con actividad contra C. difficile . ^{2 , 3} Los estudios in vitro son un componente necesario del proceso de desarrollo del fármaco. Tradicionalmente, se usan estudios de susceptibilidad in vitro y matanza para validar futuros estudios en animales y otros in vivo .

Aunque estos métodos cumplen un papel importante para evaluar la acción de matar, no capturan la respuesta fenotípica de las células al tratamiento farmacológico. Mediante la incorporación de microscopía electrónica de barrido (SEM) conD matando los estudios cinéticos, una caracterización más completa de los efectos directos antibióticos es posible. ^{5 , 6 , 7} Aquí, se presenta un método en el que SEM se utiliza como un medio para perfilar la eficacia del tratamiento con antibióticos.

Protocol

1. Aislar C. difficile de diferentes fuentes ambientales o clínicas Aislados medioambientales: Utilizando un calibre de algodón preesterilizado (ligeramente humedecido con NaCl al 0,85%), limpie con un hisopo la superficie de cualquier área de interés (piso, puerta, manija, estante, etc. ). 8 Asegúrese de usar guantes estériles y coloque el hisopo en un tubo esterilizado una vez completado. Aislamientos clínicos (heces): Placa de 10 a 100 mg de muestr…

Representative Results

Clostridium difficile es una bacteria formadora de esporas y por lo tanto es esencial para determinar las diferencias morfológicas entre las células vegetativas y esporas antes de cualquier análisis funcional. La Figura 1 muestra imágenes representativas de células vegetativas que fueron capturadas durante la fase exponencial de la curva de crecimiento y las células de esporas. Como se muestra, las células vegetativas son largas, lisas, estructur…

Discussion

El objetivo del presente estudio fue crear un método de alto rendimiento para aislar C. difficile y probar la susceptibilidad a los antibióticos mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) como medio para una caracterización más completa de la acción farmacológica del antibiótico. Usando los protocolos esbozados aquí, hemos demostrado que la obtención de imágenes de la respuesta fenotípica de la célula al tratamiento con antibióticos puede revelar una visión de la acción farmacológica de…

Materials

cotton gauze	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50mL tubes	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterion	C5141
L-cysteine	Alfa Aesar	A10389
yeast extract	Criterion	C741
sodium taurocholate	Alfa Aesar	A18346
anaerobic chamber	Coy		vinyl anaerobic chamber
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates	Anaerobe systems	AS-213
blood agar plates	Hardy diagnostics	A-10
latex agglutination reagent	Oxoid	DR1107A	C. diff test kit
microcentrifuge tubes	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	50-259-98
microscope slides	J. Melvin freed brand	7525M	75x25mm
flow hood	Labconco	Class II type A2	biosafety cabinet
desk sputtering machine	Denton Vacuum	Desk II
tape	Plastic Core	05072-AB	SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape
gold	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil
scanning electron microscope	FEI	XL-30