Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.
Bedömning av antibiotikabehandling med ny läkemedelsutveckling riktad mot anaeroba bakterier är svår och tekniskt krävande. För att få insikt i möjlig MOA kan morfologiska förändringar i samband med antibiotisk exponering visualiseras med hjälp av skanningelektronmikroskopi (SEM). Integrering av SEM-bildbehandling med traditionella dödskurvor kan förbättra vår insikt i narkotikahantering och utveckla läkemedelsutvecklingsprocessen. För att testa denna premiss utfördes dödkurvor och SEM-studier med användning av läkemedel med känd men olika MOA (vankomycin och metronidazol). C. difficile celler (R20291) odlades med eller utan närvaro av antibiotikum i upp till 48 timmar. Under hela 48 timmarsintervallet samlades celler upp på flera tidpunkter för att bestämma antibiotikabehandling och för bildbehandling på SEM. I överensstämmelse med tidigare rapporter hade vankomycin och metronidazol signifikant baktericidaktivitet efter 24 timmars behandling, mätt genom kolonnbildande enhet (CFU) länderting. Med SEM-bildbehandling bestämde vi att metronidazol hade signifikanta effekter på celllängden (> 50% minskning av celllängden för varje antibiotikum, P <0,05) jämfört med kontroller och vankomycin. Medan det fenotypiska svaret på läkemedelsbehandling inte har dokumenterats tidigare på detta sätt är de förenliga med läkemedlets MOA som visar mångfalden och tillförlitligheten av avbildningen och mätningarna och tillämpningen av denna teknik för andra experimentella föreningar.
Clostridium difficile är en gram positiv, sporbildande bakterie, vilket orsakar cirka 500 000 infektioner årligen i USA och betraktas som en brådskande brådskande patogen av Centers for Disease Control and Prevention (CDC), den högsta risknivån. 1 Det senaste decenniet har sett en betydande läkemedelsutveckling i antimikrobiella medel med aktivitet mot C. difficile . 2 , 3 In vitro- studier är en nödvändig del av läkemedelsutvecklingsprocessen. 4 Traditionellt används in vitro- mottagnings- och tidsdödstudier för att validera framtida djur och andra in vivo- studier.
Medan dessa metoder bidrar till en viktig roll för utvärdering av dödande åtgärder, fångar de inte cellernas fenotypiska respons på farmakologisk behandling. Genom att inkorporera skanningelektronmikroskopi (SEM) med standarD dödande kinetiska studier är en mer noggrann karakterisering av antibiotikabehandlingarna möjliga. 5 , 6 , 7 Här presenterar vi en metod där SEM används som ett sätt att profilera effekten av antibiotikabehandling.
Målet med den aktuella studien var att skapa en hög genomströmningsmetod för att isolera C. difficile och testa antibiotikaresistens med hjälp av skanningelektronmikroskopi (SEM) som ett medel för en mer noggrann karakterisering av antibiotikans farmakologiska verkan. Med hjälp av de protokoll som skisseras här har vi visat att avbildning av cellens fenotypiska respons på antibiotikabehandling kan avslöja insikt i läkemedlets farmakologiska verkan. Sammantaget tar bildbildningsdelen av detta protokol…
The authors have nothing to disclose.
These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.
cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
NaCl | Macron | 7532 | |
50mL tubes | Falcon | 352098 | |
Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
yeast extract | Criterion | C741 | |
sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
PBS | Gibco | 10010-031 | |
4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75x25mm |
flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
scanning electron microscope | FEI | XL-30 |