Ett protokoll för att karaktärisera de morfologiska förändringarna av<em> Clostridium difficile</em> Som svar på antibiotisk behandling

Summary

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Abstract

Bedömning av antibiotikabehandling med ny läkemedelsutveckling riktad mot anaeroba bakterier är svår och tekniskt krävande. För att få insikt i möjlig MOA kan morfologiska förändringar i samband med antibiotisk exponering visualiseras med hjälp av skanningelektronmikroskopi (SEM). Integrering av SEM-bildbehandling med traditionella dödskurvor kan förbättra vår insikt i narkotikahantering och utveckla läkemedelsutvecklingsprocessen. För att testa denna premiss utfördes dödkurvor och SEM-studier med användning av läkemedel med känd men olika MOA (vankomycin och metronidazol). C. difficile celler (R20291) odlades med eller utan närvaro av antibiotikum i upp till 48 timmar. Under hela 48 timmarsintervallet samlades celler upp på flera tidpunkter för att bestämma antibiotikabehandling och för bildbehandling på SEM. I överensstämmelse med tidigare rapporter hade vankomycin och metronidazol signifikant baktericidaktivitet efter 24 timmars behandling, mätt genom kolonnbildande enhet (CFU) länderting. Med SEM-bildbehandling bestämde vi att metronidazol hade signifikanta effekter på celllängden (> 50% minskning av celllängden för varje antibiotikum, P <0,05) jämfört med kontroller och vankomycin. Medan det fenotypiska svaret på läkemedelsbehandling inte har dokumenterats tidigare på detta sätt är de förenliga med läkemedlets MOA som visar mångfalden och tillförlitligheten av avbildningen och mätningarna och tillämpningen av denna teknik för andra experimentella föreningar.

Introduction

Clostridium difficile är en gram positiv, sporbildande bakterie, vilket orsakar cirka 500 000 infektioner årligen i USA och betraktas som en brådskande brådskande patogen av Centers for Disease Control and Prevention (CDC), den högsta risknivån. ¹ Det senaste decenniet har sett en betydande läkemedelsutveckling i antimikrobiella medel med aktivitet mot C. difficile . ^{2 , 3} In vitro- studier är en nödvändig del av läkemedelsutvecklingsprocessen. ⁴ Traditionellt används in vitro- mottagnings- och tidsdödstudier för att validera framtida djur och andra in vivo- studier.

Medan dessa metoder bidrar till en viktig roll för utvärdering av dödande åtgärder, fångar de inte cellernas fenotypiska respons på farmakologisk behandling. Genom att inkorporera skanningelektronmikroskopi (SEM) med standarD dödande kinetiska studier är en mer noggrann karakterisering av antibiotikabehandlingarna möjliga. ^{5 , 6 , 7} Här presenterar vi en metod där SEM används som ett sätt att profilera effekten av antibiotikabehandling.

Protocol

1. Isolering C. difficile från olika miljö- eller kliniska källor Miljöisoler: Använd en försteriliserad bomullsmätare (lätt fuktad med 0,85% NaCl), vattna på ytan av något intresseområde (golv, dörr, handtag, hyllan etc. ). 8 Var noga med att bära sterila handskar och placera pinnen i ett steriliserat rör efter avslutat. Kliniska isolat (avföring): Placera 10 till 100 mg kliniska avföringsprover på cefoxitin-cykloserin-fruktosagar (CCFA) me…

Representative Results

Clostridium difficile är en sporbildande bakterie och det är därför viktigt att bestämma morfologiska skillnader mellan vegetativa och sporeceller före någon funktionell analys. Figur 1 visar representativa bilder av vegetativa celler som fångades under exponentialfasen av tillväxtkurvan och sporcellerna. Som framgår är vegetativa celler långa, släta, stavformade strukturer medan sporer är små, ovala strukturer som har ett grovt yttre. Funktionell…

Discussion

Målet med den aktuella studien var att skapa en hög genomströmningsmetod för att isolera C. difficile och testa antibiotikaresistens med hjälp av skanningelektronmikroskopi (SEM) som ett medel för en mer noggrann karakterisering av antibiotikans farmakologiska verkan. Med hjälp av de protokoll som skisseras här har vi visat att avbildning av cellens fenotypiska respons på antibiotikabehandling kan avslöja insikt i läkemedlets farmakologiska verkan. Sammantaget tar bildbildningsdelen av detta protokol…

Materials

cotton gauze	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50mL tubes	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterion	C5141
L-cysteine	Alfa Aesar	A10389
yeast extract	Criterion	C741
sodium taurocholate	Alfa Aesar	A18346
anaerobic chamber	Coy		vinyl anaerobic chamber
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates	Anaerobe systems	AS-213
blood agar plates	Hardy diagnostics	A-10
latex agglutination reagent	Oxoid	DR1107A	C. diff test kit
microcentrifuge tubes	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	50-259-98
microscope slides	J. Melvin freed brand	7525M	75x25mm
flow hood	Labconco	Class II type A2	biosafety cabinet
desk sputtering machine	Denton Vacuum	Desk II
tape	Plastic Core	05072-AB	SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape
gold	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil
scanning electron microscope	FEI	XL-30