A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.
Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.
An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ1-42 between 150-4,000 pg/mL.
अल्जाइमर रोग (ई) मनोभ्रंश का सबसे आम रूप है और करीब 35 लाख लोगों के लिए दुनिया भर में 1 को प्रभावित करता है। रोग व्यापक रूप से ई रोगजनन के मूल में झूठ बोलने के लिए माना जाता है की नयूरोपथोलोगिकल पहचान hyperphosphorylated ताउ प्रोटीन 2 के intracellular neurofibrillary tangles और बाह्य सजीले टुकड़े एकत्रित amyloid बीटा (Aβ) पेप्टाइड्स 3 से मिलकर कर रहे हैं। इस के साथ लाइन में, बायोमार्कर से विवो में पट्टिका विकृति के आकलन हाल ही में ई 4 के लिए अनुसंधान नैदानिक मानदंडों में शामिल किया गया है। Aβ 1-42 की सीएसएफ माप के लिए, कई immunoassays उपलब्ध हैं और कई नैदानिक प्रयोगशालाओं 5 में इस्तेमाल कर रहे हैं। सीएसएफ में Aβ 1-42 की एकाग्रता लगभग 50% संज्ञानात्मक सामान्य बुजुर्गों की तुलना में ई रोगियों में कम है, बीआर में सजीले टुकड़े में पेप्टाइड के बयान को दर्शाती हैऐन 6, 7।
ये मुख्य रूप से बायोमार्कर immunoassays (यानी, एंटीबॉडी आधारित तकनीक) का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं, लेकिन इन assays मैट्रिक्स प्रभाव 8 से प्रभावित किया जा सकता है। विभिन्न प्रौद्योगिकी प्लेटफार्मों पर immunoassays और परख मानकीकरण 9 की कमी का उपयोग करते हैं, 10 मुश्किल 11, 12 वैश्विक कट-ऑफ सांद्रता की शुरूआत करता है। एक विश्लेषणात्मक मान्य आरएमपी अलग परख प्लेटफार्मों की वर्दी अंशांकन अनुमति होगी, आदर्श विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों भर में बेहतर तुलनीयता में और समग्र माप परिवर्तनशीलता के लिए योगदान कारकों के बेहतर नियंत्रण में जिसके परिणामस्वरूप।
Aβ 1-42 की पूर्ण मात्रा का ठहराव विकसित नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विधि का उपयोग एंटीबॉडी आधारित techn के साथ जुड़े मुद्दों के कई काबूiques। विधि, में प्रयोगशाला चिकित्सा traceability के लिए संयुक्त समिति (JCTLM डेटाबेस पहचान संख्या C11RMP9), द्वारा एक आरएमपी के रूप में सूचीबद्ध Aβ 1-42 के पूर्ण एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक प्रमाणित संदर्भ सामग्री (सीआरएम) में सीएसएफ Aβ 1 अनुरूप करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा तकनीक और विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों भर -42 माप। वर्णित कार्यप्रवाह चिकित्सा के अन्य क्षेत्रों के भीतर पेप्टाइड्स और प्रोटीन के लिए उम्मीदवार संदर्भ विधियों के विकास के लिए प्रासंगिकता का होना चाहिए।
वर्णित विधि के लिए, बजाय एक किराए की मैट्रिक्स का उपयोग कर के, हम किराए की analyte दृष्टिकोण 13, 14, 15, 16, जो मानव सीएसएफ में अंशांकन सक्षम बनाता है इस्तेमाल किया। क?…
The authors have nothing to disclose.
This work was performed on behalf of the International Federation of Clinical Chemistry Working Group on CSF Proteins, which has the following composition: Kaj Blennow (Chair) and Henrik Zetterberg, Gothenburg University, Sweden; Les Shaw and Magdalena Korecka, University of Philadelphia, PA, USA; Ingrid Zegers, Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, Belgium; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Germany; and Rand Jenkins, PPD Bioanalytical Laboratory, Richmond, VA, USA; Randall Bateman, Washington University, MO, USA; and H Vanderstichele, Innogenetics NV, Ghent, Belgium. This work was also part of the Global Consortium for Biomarker Standardization CSF Reference Methods Working Group, which is led by Maria C. Carrillo, Ph.D., Senior Director, Medical & Scientific Relations, Alzheimer’s Association. The study was supported by The Swedish Research Council (grants #14002, #521-2011-4709, and #2013-2546); the Knut and Alice Wallenberg Foundation; Demensförbundet; and Emil and Wera Cornell’s, Aina Wallström and Mary-Ann Sjöblom’s, Gun and Bertil Stohne’s, Magnus Bergvall’s, and Gamla Tjänarinnor’s Foundations.
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |