लिम्फोसाइट परिस्त्राव के विश्लेषण से एक का उपयोग करना<em> इन विट्रो</em> मानव रक्त मस्तिष्क बाधा के मॉडल
Summary
Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.
Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में लिम्फोसाइट परिस्त्राव प्रतिरक्षा निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है। लिम्फोसाइट परिस्त्राव के रोग से संबंधित परिवर्तन सीएनएस में pathophysiological परिवर्तन हो सकती है। इस प्रकार, सीएनएस में लिम्फोसाइट प्रवास के जांच भड़काऊ सीएनएस रोगों को समझने के लिए और नई चिकित्सा दृष्टिकोण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ हम मानव रक्त मस्तिष्क बाधा के इन विट्रो मॉडल लिम्फोसाइट परिस्त्राव अध्ययन करने के लिए प्रस्तुत करते हैं। मानव मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (HBMEC) confluently एक झरझरा polyethylene terephthalate पर उगाए जाते हैं रक्त मस्तिष्क बाधा के अन्तःचूचुक नकल करने के लिए सम्मिलित Transwell। बैरियर समारोह zonula occludens इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री, transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) माप के साथ-साथ इवांस नीले पारगमन के विश्लेषण से मान्य है। एन के कोशिकाओं – यह मॉडल इस तरह के CD56 उज्ज्वल CD16 मंद / के रूप में दुर्लभ लिम्फोसाइट सबसेट diapedesis की जांच की अनुमति देता है। Furthermअयस्क, अन्य कोशिकाओं, साइटोकिन्स और chemokines, रोग से संबंधित परिवर्तन, और लिम्फोसाइटों के प्रवासी क्षमता पर अलग उपचार परहेज के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है। अंत में, भड़काऊ उत्तेजनाओं के प्रभाव के साथ-साथ endothelial बाधा पर विभिन्न उपचार परहेज का विश्लेषण किया जा सकता है।
Introduction
ऊतकों में रक्त से लिम्फोसाइट प्रवास प्रतिरक्षा निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है। विशिष्ट आणविक बातचीत के एक अनुक्रम छोटी आंत, त्वचा, लिम्फ नोड्स, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), और अन्य ऊतकों 1 में साइट विशिष्ट परिस्त्राव सुनिश्चित करता है। लिम्फोसाइट प्रवास में बदलाव व्यापक प्रसार रोगों 2 के एक नंबर के pathophysiology में शामिल हैं। प्रतिरक्षा विशेषाधिकार प्राप्त सीएनएस में प्रवासन कसकर नियंत्रित किया जाता है और उसके अनुसार इस प्रक्रिया के परिवर्तन इंसेफैलोमाईलिटिस 3, neuromyelitis ऑप्टिकल, स्ट्रोक, और मल्टिपल स्क्लेरोसिस (एमएस) 2, 4, 5, 6, 7 की तरह सीएनएस से संबंधित बीमारियों में शामिल हैं। इसलिए, यह लिम्फोसाइट परिस्त्राव अध्ययन करने के लिए बेहतर रोग pathophysiology को समझने के लिए और एक के लिए उपकरण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है इस बीमारी के बोझ 8, 9, 10, 11, 12 की उन्नति।
लिम्फोसाइटों अलग रास्तों से सीएनएस में चले जाते हैं। रंजित जाल के भीतर और भर में रक्त मस्तिष्क बाधा रक्त मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा के माध्यम से अंतरिक्ष अवजालतनिका में postcapillary venules के माध्यम से तरल पदार्थ का स्त्राव वर्णित किया गया है 1, 13, 14, 15। रक्त मस्तिष्क बाधा पार प्रवासन अंतर्कलीय कोशिकाओं 14 के साथ लिम्फोसाइट के बातचीत के द्वारा आयोजित किया जाता है। इसके विपरीत परिधि में endothelial कोशिकाओं में, सीएनएस के अंतर्कलीय कोशिकाओं, तंग जंक्शन अणुओं की उच्च मात्रा व्यक्त जिससे सख्ती से कोशिकाओं और प्रोटीन रक्त मस्तिष्क बाधा पार करने में सक्षम की मात्रा को सीमितलड़की = "xref"> 16। तंग जंक्शनों के ढीला में सूजन परिणाम और आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है; इस प्रकार, सीएनएस 1, 17, 18 में लिम्फोसाइट प्रवास को बढ़ाने।
रक्त मस्तिष्क बाधा के माध्यम से तरल पदार्थ का स्त्राव एक multistep प्रक्रिया है। Endothelial कोशिकाओं को टेदर लिम्फोसाइटों और फिर एक प्रक्रिया मुख्य रूप से selectins 1, 15 द्वारा मध्यस्थता में अन्तःचूचुक साथ रोल। बाद में, अन्तःचूचुक द्वारा स्रावित chemokines और संबंधित केमोकाइन रिसेप्टर्स के बीच संबंधों लिम्फोसाइटों पर व्यक्त इंटेग्रिन के गठनात्मक परिवर्तन को प्रेरित है, जिससे अंतर्कलीय कोशिकाओं 1 के लिए फर्म आसंजन को बढ़ावा देने के। अंत में, या तो रक्त प्रवाह के खिलाफ endothelial बाधा के साथ क्रॉल लिम्फोसाइटों परिवाहकीय अंतरिक्ष में transmigrating से पहले, या तुरंत और सीधे transm रोकनेफर्म आसंजन 1, 19, 20 के स्थल पर igrate। सभी लिम्फोसाइट परिस्त्राव के लिए निम्न चरणों का अलग तकनीक का उपयोग करते हुए 21 इन विट्रो में विश्लेषण किया जा सकता। समय-अंतराल वीडियो माइक्रोस्कोपी प्रारंभिक टेदरिंग और रोलिंग 15 अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। आसंजन assays फर्म गिरफ्तारी के बारे में विस्तृत जानकारी बाधाओं 22 endothelial उपलब्ध हैं। स्थानांतरगमन assays के रूप में यहां प्रदर्शन किया प्रतिरक्षा सेल स्थानांतरगमन 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 के विश्लेषण अनुमति देते हैं।
इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल में मानव का उपयोग करना, हम एक उच्च migr कि हाल ही में दिखा सकता हैउनके CD56 के लिए मंद CD16 + समकक्षों अंतः मस्तिष्कावरणीय डिब्बे 21 में इस एन.के. सेल सबसेट की प्रबलता से परिलक्षित किया गया था की तुलना में एन के कोशिकाओं – CD56 उज्ज्वल CD16 के atory क्षमता मंद /। इस प्रकार, हमारे प्रयोगात्मक सेटअप इन विवो स्थिति की नकल करने के उपयुक्त हो रहा है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम मानव रक्त मस्तिष्क बाधा पार लिम्फोसाइटों की स्थानांतरगमन की जांच के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करते हैं। सीएनएस को लिम्फोसाइट प्रवास के इन विट्रो विश्लेषण में लिम्फोसाइट परिस्त्राव, संभा?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 “Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease” (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).
Materials
| PBS | Gibco | 14190-094 | without CaCl2 or MgCl2 |
| Fibronectin 1mg/mL | Sigma | F1141-5MG | from bovine plasma |
| T-25 cell culture flask | Greiner BioOne | 690160 | |
| HBMEC | ScienCell | 1000 | |
| Pelobiotech | PB-H-6023 | ||
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | |
| ECM-b | ScienCell | 1001-b | |
| FBS | ScienCell | 1001-b | |
| Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 1001-b | |
| Endothelial cell growth supplement | ScienCell | 1001-b | |
| Transwell | Corning | 3472 | clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size |
| 96-well flat bottom plate | Corning | 3596 | |
| Evans blue | Sigma | E2129-10G | stock solution: 1 g/50 mL PBS |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x concentrated |
| Infinite M200Pro | Tecan | ||
| 96-well black flat bottom plate | Greiner BioOne | 675086 | |
| 48-well plate | Corning | 3526 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
| Flow Count Fluorospheres | Beckman Coulter | 7547053 | |
| Na-EDTA | Sigma | E5134 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Gallios 10-color flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Kaluza 1.5a | Beckman Coulter | ||
| TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
| CD3-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 300430 | clone UCHT1 |
| CD56-PC7 | Beckman Coulter | A21692 | clone N901 |
| CD16-A750 | Beckman Coulter | A66330 | clone 3G8 |
| CD4-FITC | Biolegend | 300506 | clone RPA-T4 |
| CD8-A700 | Beckman Coulter | A66332 | clone B9.11 |
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