L'analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em> In Vitro</em> Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Summary

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Abstract

Linfociti stravaso nel sistema nervoso centrale (CNS) è fondamentale per la sorveglianza immunitaria. alterazioni correlati alla malattia di linfociti stravaso possono provocare alterazioni fisiopatologiche nel SNC. Così, l'indagine della migrazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale è importante per capire le malattie infiammatorie del sistema nervoso centrale e di sviluppare nuovi approcci di terapia. Qui vi presentiamo un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana per studiare linfociti stravaso. cellule endoteliali microvascolari cerebrali umano (HBMEC) sono confluently coltivate su un tereftalato di polietilene poroso Transwell inserire per imitare l'endotelio della barriera emato-encefalica. funzione di barriera è convalidato dal zonula occludere immunoistochimica, transendoteliale resistenza elettrica (TEER) misurazioni così come l'analisi di Evans blue permeazione. Questo modello permette di indagine della diapedesi delle sottopopolazioni linfocitarie rari come CD56 CD16 ^{luminoso dim / –} cellule NK. Furthermminerale, gli effetti di altre cellule, citochine e chemochine, alterazioni legati alla malattia e distinti regimi di trattamento sulla capacità migratoria dei linfociti può essere studiato. Infine, l'impatto degli stimoli infiammatori oltre a diversi regimi di trattamento sulla barriera endoteliale possono essere analizzati.

Introduction

migrazione dei linfociti dal sangue nei tessuti è cruciale per la sorveglianza immunitaria. Una sequenza di interazioni molecolari specifici assicura portale di stravaso specifico in piccolo intestino, pelle, linfonodi, il sistema nervoso centrale (SNC), e altri tessuti ^1. Alterazioni nella migrazione dei linfociti sono coinvolti nella fisiopatologia di diverse malattie larghe diffusione ^2. Migrazione nel CNS immuno-privilegiato è strettamente regolato e di conseguenza alterazioni di questo processo sono coinvolti nelle patologie del SNC sono collegati come encefalomielite ^3, neuromielite ottica, ictus, e la sclerosi multipla (MS) ^{2, 4, 5, 6, 7.} Pertanto, è importante studiare linfociti stravaso di capire meglio la malattia fisiopatologia e di sviluppare strumenti per un melioration di malattia onere ^{8, 9, 10, 11, 12.}

Linfociti migrano nel SNC tramite percorsi distinti. Stravaso attraverso venule postcapillari nello spazio subaracnoideo attraverso la barriera sangue fluido cerebrospinale all'interno del plesso coroide e attraverso la barriera emato-encefalica sono stati descritti ^{1, 13, 14, 15.} Migrazione attraverso la barriera ematoencefalica è condotta dall'interazione di linfociti con cellule endoteliali ^14. Contrariamente alle cellule endoteliali in periferia, cellule endoteliali del SNC esprimono elevate quantità di molecole di giunzione strette, così strettamente limitando la quantità di cellule e proteine ​​in grado di attraversare la barriera emato-encefalicalass = "xref"> 16. l'infiammazione in allentamento delle giunzioni strette e induce l'espressione di molecole di adesione; quindi, aumentando la migrazione dei linfociti nel SNC ^{1, 17, 18.}

Lo stravaso attraverso la barriera emato-encefalica è un processo a più fasi. Linfociti cordicella per le cellule endoteliali e quindi rotolare lungo l'endotelio in un processo principalmente mediato da selectine ^{1, 15.} Successivamente, le interazioni tra chemochine secrete dall'endotelio ed i rispettivi recettori per chemochine espressi sui linfociti inducono cambiamenti conformazionali di integrine, promuovendo così ferma adesione alle cellule endoteliali ^1. Infine, linfociti sia strisciare lungo la barriera endoteliale contro il flusso di sangue prima trasmigranti nello spazio perivascolare, o stallo immediatamente e direttamente trasmigrate al sito della ditta adesione ^{1, 19, 20.} Tutte queste fasi di linfociti stravaso possono essere analizzate in vitro con tecniche distinti ^21. Time-lapse microscopia video viene utilizzato per studiare il tethering iniziale e rotolamento ^15. Saggi di adesione forniscono informazioni dettagliate su arresto ditta per endoteliali barriere ^22. Saggi trasmigrazione come dimostrato qui consentono l'analisi della trasmigrazione immuno-cella ^{21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.}

Utilizzando l'umano in vitro di sangue modello encefalica, potremmo recentemente dimostrare che una più alta migrcapacità Atory di CD56 CD16 ^{luminoso dim / –} cellule NK rispetto al loro CD56 ^dim CD16 ⁺ controparti è riflessa da una predominanza di questo sottogruppo di cellule NK nel vano intratecale ^21. Così, il nostro apparato sperimentale sembra essere adatto per simulare la situazione in vivo.

Protocol

1. Colture Cellulari del cervello umano cellule endoteliali microvascolari (HBMEC) Rivestimento di fiaschi di coltura cellulare Per preparare la soluzione di fibronectina, aggiungere 10 ml di PBS in una provetta da centrifuga 15. Aggiungere 150 microlitri fibronectina e mescolare bene. Per coprire il fondo un pallone di coltura di cellule T-25 aggiungere 2 mL della soluzione fibronectina. Incubare la beuta di coltura cellulare per almeno 3 ore a 37 ° C in incubatore. Rivestito fibronectina…

Representative Results

Risultati rappresentativi mostrano trasmigrazione di cellule NK e sottoinsiemi di cellule T usando il sangue-cervello modello barriera umana (Figura 1A) sono mostrate. L'integrità del monostrato HBMEC stato convalidato dalla colorazione della molecola giunzioni strette ZO-1, misurazioni transendoteliale resistenza elettrica (Teer), ed Evans blu permeazione (Figura 1B). Dopo 3 – 4 giorni cultura HBMEC espresso molecola giunzioni strette ZO-1 …

Discussion

Qui vi presentiamo una tecnica per indagare la trasmigrazione dei linfociti attraverso la barriera emato-encefalica umana. In vitro analisi della migrazione dei linfociti al sistema nervoso centrale è importante per studiare i processi fondamentali di linfociti stravaso, potenziali alterazioni correlati alla malattia, e nuovi approcci terapeutici.

Diverse modifiche del modello di barriera emato-encefalica sono possibili. Ad esempio, le cellule del compartimento superiore potrebbero…

Materials

PBS	Gibco	14190-094	without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1mg/mL	Sigma	F1141-5MG	from bovine plasma
T-25 cell culture flask	Greiner BioOne	690160
HBMEC	ScienCell	1000
	Pelobiotech	PB-H-6023
Accutase	Sigma	A6964-100ML
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicillin/Streptomycin	ScienCell	1001-b
Endothelial cell growth supplement	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size
96-well flat bottom plate	Corning	3596
Evans blue	Sigma	E2129-10G	stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27	Gibco	17504-044	50x concentrated
Infinite M200Pro	Tecan
96-well black flat bottom plate	Greiner BioOne	675086
48-well plate	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Flow Count Fluorospheres	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
Gallios 10-color flow cytometer	Beckman Coulter
Kaluza 1.5a	Beckman Coulter
TNF-α	Peprotech	300-01A
IFN-γ	Peprotech	300-02
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolegend	300430	clone UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	clone N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	clone 3G8
CD4-FITC	Biolegend	300506	clone RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	clone B9.11