इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कैल्शियम इमेजिंग के लिए तीव्र Neuronal ऊतक लंबे समय तक ऊष्मायन
Summary
एक बार शरीर से हटा दिया, न्यूरोनल ऊतक बहुत पर्यावरण की स्थिति से प्रभावित होता है, के बाद 6 ऊतक के अंतिम गिरावट के लिए अग्रणी – 8 h। एक अनूठा ऊष्मायन विधि है, जो बारीकी से नजर रखता है और ऊतक के बाह्य वातावरण को नियंत्रित करता है का उपयोग करना, ऊतक व्यवहार्यता काफी> 24 घंटे के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
8 घंटे विच्छेदन के बाद – एक्यूट न्यूरोनल ऊतक की तैयारी, मस्तिष्क के स्लाइस और रेटिना wholemount, आमतौर पर केवल 6 बनाए रखा जा सकता है। इस प्रयोगात्मक समय सीमा है, और जानवरों है कि अध्ययन के अनुसार उपयोग किया जाता है की संख्या बढ़ जाती है। इस सीमा विशेष रूप से ऐसे कैल्शियम इमेजिंग कि स्नान लागू रंगों के साथ लंबे समय तक पूर्व ऊष्मायन की आवश्यकता के रूप में प्रभाव डालता प्रोटोकॉल। 3 के भीतर घातीय बैक्टीरिया विकास – टुकड़ा करने की क्रिया के बाद 4 घंटे कसकर ऊतक स्वास्थ्य में कमी के साथ जोड़ा जाता है। इस अध्ययन में तीव्र तैयारी में बैक्टीरिया के प्रसार को सीमित समय की लंबी अवधि (> 24 ज) एंटीबायोटिक दवाओं, बाँझ प्रक्रियाओं, या टिशू कल्चर मीडिया वृद्धि कारक युक्त बिना जरूरत के लिए के लिए व्यवहार्य न्यूरोनल ऊतक बनाए रखने के लिए के लिए एक विधि का वर्णन है। पराबैंगनी विकिरण के माध्यम से बाह्य तरल पदार्थ साइकिल और 15 पर एक कस्टम होल्डिंग कक्ष में ऊतक रखने से – 16 डिग्री सेल्सियस, ऊतक electrophysiological गुण, या कैल्शियम si में कोई अंतर नहीं चलता> 24 घंटे postdissection पर intracellular कैल्शियम रंगों के माध्यम से gnaling। इन तरीकों से न केवल तीव्र न्यूरोनल ऊतक का उपयोग करने वालों के लिए प्रयोगात्मक समय का विस्तार होगा, लेकिन प्रयोगात्मक लक्ष्यों को पूरा करने के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या कम हो जाएगा, और तीव्र न्यूरोनल ऊतक ऊष्मायन के लिए एक स्वर्ण मानक की स्थापना की जाएगी।
Introduction
इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कार्यात्मक इमेजिंग (कैल्शियम, वोल्टेज संवेदनशील ध्वज) तंत्रिका विज्ञान में सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक तकनीक से दो हैं। मस्तिष्क टुकड़ा तैयारियाँ और रेटिना wholemount, जो यहाँ की जांच की जाएगी, anesthetics या मांसपेशियों को ढीला से संदूषण के बिना electrophysiological गुण और synaptic कनेक्टिविटी की जांच करने का एक साधन प्रदान करते हैं। मस्तिष्क के स्लाइस और रेटिना wholemount उनकी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने, संस्कृतियों या सेल homogenates के विपरीत, विशिष्ट सर्किट और मस्तिष्क नेटवर्क 1 के अध्ययन की अनुमति। पृथक ऊतक से रिकॉर्डिंग दिल की धड़कन और श्वसन के साथ जुड़े आंदोलनों के रूप में विवो रिकॉर्डिंग से अधिक लाभ का सफाया कर रहे हैं। इसके अलावा, प्रत्यक्ष दृश्य कोशिकाओं के विशिष्ट वर्गों को निशाना बनाया जा सकता है, और औषधीय उपकरण 2, 3 के स्थानीय आवेदन की अनुमति देता है।
पैच दबाना रिकॉर्डिंग और कैल्कIUM डाई लोड हो रहा है रेटिना wholemount में इनर के अस्तित्व झिल्ली (ILM) है, जो रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल (RGC) परत को शामिल किया गया है और कोशिकाओं के लिए सीधी पहुँच रोकता सीमित द्वारा जटिल है। सामान्यतया, यह झिल्ली एक गिलास पिपेट के साथ दूर scraped है एक एकल कोशिका पर एक पैच पिपेट और एक gigaohm मुहर के गठन के प्रत्यक्ष आवेदन की अनुमति है। इसके अलावा, स्नान लागू कैल्शियम रंगों इल्म पार नहीं करते हैं और या तो यह झिल्ली के नीचे 4 इंजेक्शन होना चाहिए, प्रतिगमनपूर्वक ऑप्टिक तंत्रिका 5 पर निम्न इंजेक्शन ले जाया या ऊतक 6 के माध्यम से electroporated। इसके अलावा, जब रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा की एक कृंतक मॉडल का उपयोग, आरडी / आरडी माउस, इल्म मोटा और अधिक अभेद्य है। यहाँ, हम, enzymatic पाचन 7 के साथ इल्म निकालने के लिए एक तकनीक का उपयोग दोनों सर्वव्यापी कैल्शियम डाई लोड हो रहा है, और पैच दबाना recordi के लिए रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के लिए सीधी पहुँच अनुमति देने के लिएNGS 8।
या तो मस्तिष्क स्लाइस या रेटिना wholemount से सफल रिकॉर्डिंग विच्छेदन और व्यवहार्य न्यूरोनल ऊतक के ऊष्मायन पर निर्भर करते हैं। आमतौर पर, ऊतक प्रयोग की सुबह निकाले और कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) में incubated जब तक यह रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता है। आमतौर पर, ऊतक 6 के लिए व्यवहार्य रहता है – 8 घंटे, इस समय खिड़की निम्नलिखित महत्वपूर्ण गिरावट के साथ। हालांकि, दोनों के मस्तिष्क के स्लाइस और wholemount दृष्टिपटल की तैयारी आम तौर पर की तुलना में यह कम समय अवधि के भीतर से दर्ज किया जा सकता है और अधिक ऊतक का उत्पादन। नतीजतन, ऊतक अक्सर दिन के अंत में खारिज कर दिया है और विच्छेदन बाद के दिनों को फिर से पूरा हो गया है। इसका मतलब यह है एक और जानवर का उपयोग किया और ~ 2 सेटअप और विच्छेदन / धुंधला दोहराया की ज रहा है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल अधिक से अधिक 24 घंटे के लिए न्यूरोनल ऊतक के जीवन का विस्तार, कम जानवरों के अर्थ में उपयोग किया जाता है के लिए एक विधि का वर्णन है, और अधिक प्रयोगात्मक समय उपलब्ध है। ऊतक व्यवहार्यता wके रूप में electrophysiological गुण और कैल्शियम की गतिशीलता की रिकॉर्डिंग के माध्यम से मूल्यांकन, और ये गुण <4 h और> 24 घंटे postdissection के बीच पृथक किया गया।
इन परिणामों से संकेत मिलता है कि न केवल एकल कोशिका गुण लंबे समय तक ऊष्मायन के बाद बरकरार है और कार्य कर रहे हैं, लेकिन नेटवर्क गतिविधि के रूप में कैल्शियम इमेजिंग और electrophysiological रिकॉर्डिंग के द्वारा मूल्यांकन, अपरिवर्तित> 24 घंटे postdissection है। इसके अलावा, हम बताते हैं कि कैल्शियम रंगों किसी भी हानिकारक प्रभाव के कारण के बिना लंबी अवधि के लिए कोशिकाओं में रह सकते हैं। इस प्रोटोकॉल के आवेदन को दर्शाता है कि तीव्र न्यूरोनल ऊतकों में न्यूरॉन्स की कार्यात्मक गतिविधि, एक बार बाहरी वातावरण अत्यधिक विनियमित है लंबी अवधि के लिए बनाए रखा जा सकता है। इसके अलावा, के रूप में ऊतक व्यवहार्यता अलग ऊष्मायन प्रोटोकॉल के कारण प्रयोगशालाओं के बीच बहुत भिन्न होता है, इस पद्धति है कि तीव्र Neu के स्वास्थ्य में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए लागू किया जाना चाहिए आदर्श मानकों के लिए एक स्वर्ण मानक स्थापित करता हैRonal ऊतक।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लेख एक ऊष्मायन विधि का वर्णन इमेजिंग और electrophysiological प्रयोगों के लिए तीव्र न्यूरोनल ऊतक की व्यवहार्यता का विस्तार करने की है, जिससे पशु संख्या प्रयोगात्मक लक्ष्यों को पूरा करने की जरूरत को कम करने। दो म?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
Riferimenti
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