Udarbejdelse af ikke-menneskelig primat Brain Tissue til Pre-indlejring Immunohistokemi og Electron Microscopy

Summary

Her, giver vi en let, billig og tidsbesparende protokol til kemisk fix primat hjernevæv med acrolein fiksativ, giver mulighed for langsigtet opbevaring, der er kompatibel med præ-embedding immunhistokemi transmissionselektronmikroskopi.

Abstract

På trods af alle de teknologiske fremskridt på lysmikroskopi niveau, elektronmikroskopi er den eneste redskab i neurovidenskab til at undersøge og karakterisere ultrastrukturelle og morfologiske detaljer af neuroner, såsom synaptiske kontakter. God bevarelse af hjernevævet til elektronmikroskopi kan opnås ved strenge cryo-fikseringsmetoder, men disse teknikker er temmelig dyrt og begrænse brugen af ​​immunmærkning, som er afgørende at forstå forbinde identificerede neuronale systemer. Der er blevet udviklet fryse-substitutionsmetoder at tillade kombination af kryo-fiksering med immunmærkning. Imidlertid reproducerbarheden af ​​disse metodiske fremgangsmåder sædvanligvis afhængig af kostbare frysning enheder. Desuden at opnå pålidelige resultater med denne teknik er meget tidskrævende og færdighed-udfordrende. Derfor er den traditionelle kemisk fast hjerne, især med acrolein fiksativ, forbliver en tidsbesparende og billig metode til at kombinere elektronmikroskopi med immunhistokemi. Her, giver vi en pålidelig forsøgsprotokol under anvendelse af kemisk acrolein fiksering, der fører til bevarelsen af ​​primat hjernevæv og er kompatibel med præ-indlejring immunohistokemi og transmissionselektronmikroskopi mikroskopisk undersøgelse.

Introduction

Lysmikroskopi, herunder konfokal og to-foton mikroskopi, har vist sig at være et effektivt værktøj til at undersøge in vivo neuronale processer, bl.a. ^{1, 2.} Selvom den typiske rumlige opløsning på Light Mikroorganismer (LM) er ca 200 nm, nylige teknologiske fremskridt ved hjælp af forskellige lyskilder, såsom ekstrem ultraviolette og blødt røntgenbillede mikroskopi, navnlig har øget denne beslutning til en næsten 10 nm rumlig opløsning ^{3 , 4, 5.} Andre teknologiske fremskridt i billeddannelse omfatte kombineret magnetisk resonans billeddannelse med histologi og tilvejebringe en hidtil ukendt fremgangsmåde til måling af tykkelsen af myelinskeden in vivo, en parameter, der var traditionelt måles kun på elektronmikroskopisk (EM) niveau ^{6, 7.} although disse fremskridt på LM niveau giver et udmærket redskab til at studere levende processer, en detaljeret afbildning og karakterisering af strukturer, såsom synaptiske kontakter, kan kun opnås med EM, hvilket giver en opløsning, der kan nå 0,5 nm. Dog bemærkning ved EM plan kræver prøverne at være død og ændret på nogle måder, med kemiske fikseringsmidler og dehydrering processer, for at bevare den cytoarchitecture. Således kan behandlingen af biologiske prøver med høj opløsning være udfordrende på grund af stråling skader fra elektronstrålen, lav kontrast, strukturelle afvigelser af membraner, eller endda tilstedeværelsen af artefakter, der kan opstå efter dehydrering og epoxy indlejring ^{8, 9, 10.}

Bevarelse prøver i deres native form for strukturel analyse kan opnås ved anvendelse af "Cryo EM forglassede sektioner" eller CEMOVIS, en skæring tilgang,involverer hastigt frysning og indlejring prøven i glaslegemet is og undersøge sektionerne under EM ved en kryogen temperatur ^{11, 12.} Denne procedure giver mulighed for undersøgelse af prøver, mens de stadig solidt og fuldt hydreret, og dermed fjerne artefakter forårsaget af dehydrering processer ^13. Men denne metode involverer anordninger til cryo-ultramicrotomy, samt yderligere enheder på standard EM, således at denne observation ved meget lave temperaturer, som genererer betydelige ekstraomkostninger. Derudover CEMOVIS fremgangsmåde udelukker anvendelse af immunolabeling teknikker, eftersom antistoffer normalt skal inkuberes ved stuetemperatur. Alternativt er det muligt at kombinere ultrastrukturelle analyse med immunhistokemiske procedurer ved anvendelse af en fryse-substitution tilgang, hvor kryo-fikserede prøver er langsomt optøs, medens immerged i kryo-beskyttende kemikalier og er thda indlejret i specialiserede harpiks, såsom Lowicryls. Post-embedding immunmærkning kan derefter udføres på et sådant materiale ^12. Dog fryse-substitutions- og cryo-fixation teknikker er tidskrævende. De kræver installering af yderligere udstyr og kræver stadig prøver at blive udsat for organisk opløsningsmiddel og kemisk fiksativ, der kan ændre cytoarchitecture til trods for anvendelsen af en lav temperatur ^{14, 15.} Derfor, på trods af alle de teknologiske fremskridt både på LM og EM niveau, kemisk fiksering af hjernevæv, især med acrolein, forbliver en billig og tidsbesparende metode til at kombinere immunhistokemi med EM ^16.

I de sidste årtier, blev mange gjort forsøg på at finde en blanding af aldehyder, der giver den bedste vævskonservering. Før 1960'erne, er den eneste kemiske fiksativ der gav acceptable resultater for EM var osmiumtetroxid. Men osmiumtetroxid er meget giftigt og dyrt, hvilket udelukker dens anvendelse gennem karsystemet til at fastsætte organer, såsom hjernen. Acrolein blev introduceret i slutningen af 1950'erne som en pålidelig metode til dyr vævskonservering egnet til EM observation af cellulære strukturer ^17. Den gennemtrænger vævet dybere og reagerer hurtigere end andre aldehyder, når de anvendes til fiksering ved neddypning og giver god bevarelse af cytoplasmatiske komponenter, med minimal krympning af vævet ^17. Et sådant træk giver acrolein fiksering en klar fordel frem for andre aldehyder, når de anvendes i frisk væv, ved at tillade en mere nøjagtig lokalisering af levende molekylære forbindelser, såsom enzymer og andre proteiner ^18. Faktisk er det blevet valideret gennem årene som en nem, effektiv og billig metode til fiksering til visualisering på EM-niveau i mange arter, herunder padder og gnavere, som den effektivt stabilisatorZES peptider og proteiner, bibeholder antigenicitet og tilvejebringer relativt intakt ultrastruktur når de anvendes i kombination med et andet aldehyd fiksativ ^{16, 18, 19, 20, 21.} Protokoller for acrolein fiksering i gnavere er siden blevet standardiseret og anvendes i udstrakt grad, navnlig ved Pickel gruppe, for at implementere dual immunmærkning for EM ^{16, 22.} Enkelte grupper har brugt acrolein fiksering i ikke-human primat hjernevæv ^23. Men så vidt vi ved, er der kun én offentliggjort protokol effektivt beskriver kemisk fiksering med acrolein i ikke-menneskelige primater, der er kompatibel med EM immunolabeling ^24.

I denne artikel giver vi en nem og pålidelig metode til effektivt kemisk fix ikke-humen primat hjerner med acrolein, der giver mulighed for en potentielt langsigtet bevaring foruden den indlejring immunmærkning og transmission EM undersøgelse.

Protocol

Etik Statement: Alle protokoller, der involverer dyr blev godkendt af Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval og blev foretaget i overensstemmelse med den canadiske Rådet om Animal Care Guide til Pleje og anvendelsen af ​​forsøgsdyr (Ed 2.). Den her beskrevne protokol blev optimeret til voksne dyr på ca. 800 g. Mængden af ​​fiksativ bør justeres i henhold til dyrets størrelse. 1. Fremstilling af Løsninger til transkardial Perfusion Forberede 1 I…

Representative Results

I dette afsnit præsenterer vi repræsentative resultater, der blev opnået efter den observation, ved transmission EM plan af immunfarvet primat hjernevæv kemisk fikseret med en blanding af 3% acrolein og 4% PFA. Vi opnåede god bevarelse af ultrastruktur, som angivet ved den relativt intakt myelinskeden og den pæne visualisering af dobbelte membraner (figur 2A). Synaptiske kontakter, sammen med neuronale elementer fra mikromiljøet, let kan identificeres (fig…

Discussion

I denne artikel præsenterer vi en pålidelig protokol for transkardial perfusion af ikke-menneskelige primater og præ-embedding immunhistokemi egnet til EM prøve eksamen. Skønt typiske cryo-EM, såsom CEMOVIS, giver en god konservering af hjernens ultrastruktur, det begrænser også anvendelsen af immunhistokemi ^12. Andre teknikker, herunder cryo-substitution og Tokuyaso teknik, tillader post-embedding immunhistokemi, men disse teknikker er dyre på grund af yderligere anordninger er nødvend…

Materials

Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4)	Fisher scientific	S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O)	EM Science	SX0710-1
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%)	sigma	110221	3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table	Mopec	CE400
Electronic perfusion pump	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades	Feather           lance	201011           J9913	No.22 for surgery and    No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% dilution
Ethylene glycol	Fisher scientific	E178-4	30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4)	sigma	S-9125
Normal horse serum	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2% dilution
Cold-fish gelatin	Aurion	900.033	0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT	Santa Cruz biotechnology	SC-1458	1/500 dilution
Primary antibody, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 dilution
Primary antibody, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse	Vector laboratories	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100	8.8 µL/mL of A and B each
3'3 diaminobenzidine (DAB)	Sigma	D5637	0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4)	Electron microscopic science	2% 19152           4% 19150	Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin	sigma	A: M epoxy resin (44611)                B: hardener 964 (44612)                C: accelerator 960 (DY 060)  (44613)               D: plasticizer (44614)	Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups	Electron microscopic science	70048-01
Ethanol	commercial alcohols	1019C	Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide	Electron microscopic science	20401	Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides	brain research laboratories	3875-FR	Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film)	Electron microscopic science	50425-25	Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome	Leica UC7	EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim)	Diatome	UT 1081	Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife	Diatome	MC13437	equipped with a boat
Xylenes	Fisher scientific	X5SK-4
150-mesh copper grids	Electron microscopic science	G150-cu
grid-box	Electron microscopic science	71138	Can store up to 100 grids
Sodium citrate	Anachemia	81983
Lead nitrate	sigma	L-6258	Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe	terumo	SS-05L	5 mL
Syringe filter	corning	431222	0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper)	Electron microscopic science	70086-1
Parafilm	Laboratory film	PM-999
Mineral oil	Sigma	M5904