Her, giver vi en let, billig og tidsbesparende protokol til kemisk fix primat hjernevæv med acrolein fiksativ, giver mulighed for langsigtet opbevaring, der er kompatibel med præ-embedding immunhistokemi transmissionselektronmikroskopi.
På trods af alle de teknologiske fremskridt på lysmikroskopi niveau, elektronmikroskopi er den eneste redskab i neurovidenskab til at undersøge og karakterisere ultrastrukturelle og morfologiske detaljer af neuroner, såsom synaptiske kontakter. God bevarelse af hjernevævet til elektronmikroskopi kan opnås ved strenge cryo-fikseringsmetoder, men disse teknikker er temmelig dyrt og begrænse brugen af immunmærkning, som er afgørende at forstå forbinde identificerede neuronale systemer. Der er blevet udviklet fryse-substitutionsmetoder at tillade kombination af kryo-fiksering med immunmærkning. Imidlertid reproducerbarheden af disse metodiske fremgangsmåder sædvanligvis afhængig af kostbare frysning enheder. Desuden at opnå pålidelige resultater med denne teknik er meget tidskrævende og færdighed-udfordrende. Derfor er den traditionelle kemisk fast hjerne, især med acrolein fiksativ, forbliver en tidsbesparende og billig metode til at kombinere elektronmikroskopi med immunhistokemi. Her, giver vi en pålidelig forsøgsprotokol under anvendelse af kemisk acrolein fiksering, der fører til bevarelsen af primat hjernevæv og er kompatibel med præ-indlejring immunohistokemi og transmissionselektronmikroskopi mikroskopisk undersøgelse.
Lysmikroskopi, herunder konfokal og to-foton mikroskopi, har vist sig at være et effektivt værktøj til at undersøge in vivo neuronale processer, bl.a. 1, 2. Selvom den typiske rumlige opløsning på Light Mikroorganismer (LM) er ca 200 nm, nylige teknologiske fremskridt ved hjælp af forskellige lyskilder, såsom ekstrem ultraviolette og blødt røntgenbillede mikroskopi, navnlig har øget denne beslutning til en næsten 10 nm rumlig opløsning 3 , 4, 5. Andre teknologiske fremskridt i billeddannelse omfatte kombineret magnetisk resonans billeddannelse med histologi og tilvejebringe en hidtil ukendt fremgangsmåde til måling af tykkelsen af myelinskeden in vivo, en parameter, der var traditionelt måles kun på elektronmikroskopisk (EM) niveau 6, 7. although disse fremskridt på LM niveau giver et udmærket redskab til at studere levende processer, en detaljeret afbildning og karakterisering af strukturer, såsom synaptiske kontakter, kan kun opnås med EM, hvilket giver en opløsning, der kan nå 0,5 nm. Dog bemærkning ved EM plan kræver prøverne at være død og ændret på nogle måder, med kemiske fikseringsmidler og dehydrering processer, for at bevare den cytoarchitecture. Således kan behandlingen af biologiske prøver med høj opløsning være udfordrende på grund af stråling skader fra elektronstrålen, lav kontrast, strukturelle afvigelser af membraner, eller endda tilstedeværelsen af artefakter, der kan opstå efter dehydrering og epoxy indlejring 8, 9, 10.
Bevarelse prøver i deres native form for strukturel analyse kan opnås ved anvendelse af "Cryo EM forglassede sektioner" eller CEMOVIS, en skæring tilgang,involverer hastigt frysning og indlejring prøven i glaslegemet is og undersøge sektionerne under EM ved en kryogen temperatur 11, 12. Denne procedure giver mulighed for undersøgelse af prøver, mens de stadig solidt og fuldt hydreret, og dermed fjerne artefakter forårsaget af dehydrering processer 13. Men denne metode involverer anordninger til cryo-ultramicrotomy, samt yderligere enheder på standard EM, således at denne observation ved meget lave temperaturer, som genererer betydelige ekstraomkostninger. Derudover CEMOVIS fremgangsmåde udelukker anvendelse af immunolabeling teknikker, eftersom antistoffer normalt skal inkuberes ved stuetemperatur. Alternativt er det muligt at kombinere ultrastrukturelle analyse med immunhistokemiske procedurer ved anvendelse af en fryse-substitution tilgang, hvor kryo-fikserede prøver er langsomt optøs, medens immerged i kryo-beskyttende kemikalier og er thda indlejret i specialiserede harpiks, såsom Lowicryls. Post-embedding immunmærkning kan derefter udføres på et sådant materiale 12. Dog fryse-substitutions- og cryo-fixation teknikker er tidskrævende. De kræver installering af yderligere udstyr og kræver stadig prøver at blive udsat for organisk opløsningsmiddel og kemisk fiksativ, der kan ændre cytoarchitecture til trods for anvendelsen af en lav temperatur 14, 15. Derfor, på trods af alle de teknologiske fremskridt både på LM og EM niveau, kemisk fiksering af hjernevæv, især med acrolein, forbliver en billig og tidsbesparende metode til at kombinere immunhistokemi med EM 16.
I de sidste årtier, blev mange gjort forsøg på at finde en blanding af aldehyder, der giver den bedste vævskonservering. Før 1960'erne, er den eneste kemiske fiksativ der gav acceptable resultater for EM var osmiumtetroxid. Men osmiumtetroxid er meget giftigt og dyrt, hvilket udelukker dens anvendelse gennem karsystemet til at fastsætte organer, såsom hjernen. Acrolein blev introduceret i slutningen af 1950'erne som en pålidelig metode til dyr vævskonservering egnet til EM observation af cellulære strukturer 17. Den gennemtrænger vævet dybere og reagerer hurtigere end andre aldehyder, når de anvendes til fiksering ved neddypning og giver god bevarelse af cytoplasmatiske komponenter, med minimal krympning af vævet 17. Et sådant træk giver acrolein fiksering en klar fordel frem for andre aldehyder, når de anvendes i frisk væv, ved at tillade en mere nøjagtig lokalisering af levende molekylære forbindelser, såsom enzymer og andre proteiner 18. Faktisk er det blevet valideret gennem årene som en nem, effektiv og billig metode til fiksering til visualisering på EM-niveau i mange arter, herunder padder og gnavere, som den effektivt stabilisatorZES peptider og proteiner, bibeholder antigenicitet og tilvejebringer relativt intakt ultrastruktur når de anvendes i kombination med et andet aldehyd fiksativ 16, 18, 19, 20, 21. Protokoller for acrolein fiksering i gnavere er siden blevet standardiseret og anvendes i udstrakt grad, navnlig ved Pickel gruppe, for at implementere dual immunmærkning for EM 16, 22. Enkelte grupper har brugt acrolein fiksering i ikke-human primat hjernevæv 23. Men så vidt vi ved, er der kun én offentliggjort protokol effektivt beskriver kemisk fiksering med acrolein i ikke-menneskelige primater, der er kompatibel med EM immunolabeling 24.
I denne artikel giver vi en nem og pålidelig metode til effektivt kemisk fix ikke-humen primat hjerner med acrolein, der giver mulighed for en potentielt langsigtet bevaring foruden den indlejring immunmærkning og transmission EM undersøgelse.
I denne artikel præsenterer vi en pålidelig protokol for transkardial perfusion af ikke-menneskelige primater og præ-embedding immunhistokemi egnet til EM prøve eksamen. Skønt typiske cryo-EM, såsom CEMOVIS, giver en god konservering af hjernens ultrastruktur, det begrænser også anvendelsen af immunhistokemi 12. Andre teknikker, herunder cryo-substitution og Tokuyaso teknik, tillader post-embedding immunhistokemi, men disse teknikker er dyre på grund af yderligere anordninger er nødvend…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af naturvidenskab og teknik Forskningsråd of Canada (NSERC, 401.848-2011 til MP). MP modtog en karriere pris fra Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE var modtager af en ph.d. fællesskab fra FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Vi takker Marie-Josée Wallman til teknisk bistand.
Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) | Fisher scientific | S374-500 | |
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) | EM Science | SX0710-1 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher scientific | S271-3 | |
Hydroxymethyl aminomethane (THAM) | Fisher scientific | T370-500 | |
HCl | EMD | HX0603-3 | 1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection. |
NaOH | EMD | SX0590-1 | 5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection. |
Acrolein (90%) | sigma | 110221 | 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection. |
Autopsy venting table | Mopec | CE400 | |
Electronic perfusion pump | cole parmer | masterflex L/S 7523-90 | |
Needle (perfusion) | terumo | NN-1838R | 18G 1 1/2 |
Needle | terumo | NN-2713R | 21G 1/2 |
Ketamine | 20 mg/kg | ||
Xylazine | 4 mg/kg | ||
Acepromazine | 0.5 mg/kg | ||
Scalpel | |||
Scalpel blades | Feather lance | 201011 J9913 | No.22 for surgery and No. 11 for EM |
Surgical scissors | |||
Rongeurs | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | Calibrate blade before each use, when the device allows it |
Vibratome razor blade | Gillette | GIN 642107 | |
Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | 30% dilution |
Ethylene glycol | Fisher scientific | E178-4 | 30% dilution |
Sodium borohydride (NaBH4) | sigma | S-9125 | |
Normal horse serum | Jackson immunoResearch Laboratories | 008-000-121 | 2% dilution |
Cold-fish gelatin | Aurion | 900.033 | 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40% |
Primary antibody, SERT | Santa Cruz biotechnology | SC-1458 | 1/500 dilution |
Primary antibody, ChAT | Chemicon (Millipore) | AB144P | 1/25 dilution |
Primary antibody, TH | ImmunoStar | 22941 | 1/1000 dilution |
Biotinylated secondary antibody, goat | Vector laboratories | BA-9500 | 1/1000 dilution |
Biotinylated secondary antibody, mouse | Vector laboratories | BA-2000 | 1/1000 dilution |
Vectastain elite ABC kit | Vector laboratories | PK6100 | 8.8 µL/mL of A and B each |
3'3 diaminobenzidine (DAB) | Sigma | D5637 | 0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink. |
Peroxide (H2O2) 30% | Fisher scientific | H-323 | 0,005% dilution |
Osmium tetroxide (OsO4) | Electron microscopic science | 2% 19152 4% 19150 | Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection. |
Durcupan water-repellent epoxy resin | sigma | A: M epoxy resin (44611) B: hardener 964 (44612) C: accelerator 960 (DY 060) (44613) D: plasticizer (44614) | Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste. |
Alumium cups | Electron microscopic science | 70048-01 | |
Ethanol | commercial alcohols | 1019C | Dilute in distilled water with appropriate concentration |
Propylene oxide | Electron microscopic science | 20401 | Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood. |
Non-coated medium glass slides | brain research laboratories | 3875-FR | Grease surface with mineral oil |
Plastic film (Aclar embedding film) | Electron microscopic science | 50425-25 | Grease surface with mineral oil |
Ultramicrotome | Leica UC7 | EM UC7 | |
Diamond trimming tool (ultratrim) | Diatome | UT 1081 | Can use glass knife alternatively |
Ultra 45° Diatome Diamond knife | Diatome | MC13437 | equipped with a boat |
Xylenes | Fisher scientific | X5SK-4 | |
150-mesh copper grids | Electron microscopic science | G150-cu | |
grid-box | Electron microscopic science | 71138 | Can store up to 100 grids |
Sodium citrate | Anachemia | 81983 | |
Lead nitrate | sigma | L-6258 | Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light. |
Syringe | terumo | SS-05L | 5 mL |
Syringe filter | corning | 431222 | 0.2 µm |
Absorbing paper (bibulous paper) | Electron microscopic science | 70086-1 | |
Parafilm | Laboratory film | PM-999 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 |