肺的健康状况的类型和存在于肺的细支气管的免疫细胞的数目反射。我们描述了支气管肺泡灌洗技术,它允许从小鼠的下呼吸道隔离和非粘附细胞和可溶性因子的研究。
支气管肺泡灌洗(BAL)是一种实验程序,用于离体检查肺腔的细胞和无细胞含量,以了解正在进行的疾病状态。
在这里,描述了一种简单有效的方法来对小鼠肺进行BAL,而不需要特殊的工具或设备。通过将导管插入终末麻醉的小鼠的气管中来分离BAL液,通过该导管将盐水溶液滴入细支气管中。滴入的液体被轻轻地缩回以最大限度地提高BAL液体的回收和最小化剪切力。这种技术允许气道和BAL液中的细胞的存活力,功能和结构被保留。
可以应用许多技术来进一步了解肺的疾病状态。这里,常用的不同类型免疫细胞鉴定和计数的技术是其中流式细胞术与荧光标记的细胞表面特异性标志物的选择组合。本文介绍的BAL程序也可用于分析鼠肺内的感染因子,流体成分或吸入颗粒。
气道遇到许多侮辱,可能导致炎症,病原体入侵或恶性转化。排列于肺腔的上皮细胞形成哺乳动物身体的主要障碍之一。与肺泡巨噬细胞一起,它们可以防止环境威胁通过气道进入系统系统。这种威胁的例子包括有机和无机化学品,细菌和病毒。同样,可以设计特异性免疫或治疗干预来靶向肺。在所有这些情况下,对诱发反应的详细分析对于理解,干预或预防在呼吸系统内发生的生物过程是重要的。
支气管肺泡灌洗(BAL)是分析这种反应的无价的方法,因为所得样品含有关于炎症反应,免疫机制和感染性疾病进展的重要信息这可能发生在肺气道1,2 中 。通过使用BAL,可以研究渗透细胞。这与消化的肺形成对比,这使得一个“更脏”的细胞群体具有许多死亡和粘性细胞。通过将盐水溶液引入末端细支气管并随后回收该溶液来进行BAL。然后,检索到的溶液可用于定量和表型分析常驻肺和浸润炎症细胞。这种方法经常应用于研究气道疾病模型中的细胞流入,如哮喘,慢性阻塞性肺疾病(COPD)和感染性疾病模型。除了细胞组成外,肺气道的分子组成也反映在BAL液体中。为了分析这一点,酶联免疫吸附测定(ELISA),免疫印迹和通过细胞因子珠阵列同时分析多种细胞因子可以是进行以评估细胞因子和趋化因子的存在。
BAL是研究炎症性炎症性疾病动物模型中炎性细胞的流入的一种已知方法。观察改变的细胞流入( 例如淋巴细胞,嗜酸性粒细胞或嗜中性粒细胞的水平升高)可以更好地了解疾病,并且可以作为评估治疗干预性能的客观参数。
对BAL细胞分析的准确和可重复的解释需要正确执行BAL,并且收集的流体被正确处理和处理。 Stitt 3在八十多年前引入了“支气管灌洗”这个术语。 1961年,Myrvik从兔肺灌洗液中获得肺泡巨噬细胞3 。 BAL现在是一种常用的分析和监测小鼠模型肺部的方法在科学文献4,5中仍然没有报道标准化的BAL程序。此外,执行BAL可能有很多方法,因为有研究实验室使用技术3,6,7,8,9,10,11。重要的是从BAL获得的数据代表整个鼠肺,而不仅仅是肺的一部分。这种变异使不同试验结果的解释和比较复杂化。
这里描述了一种基本的,便宜的和可重复的BAL方法,其允许收集存在于小鼠的气道腔中的细胞和可溶性级分。简而言之,将导管置于暴露的气管中fa终末麻醉的老鼠。将注射器连接到导管,并将含有乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲盐水溶液引入肺中。使用柱塞通过温和地反复冲洗盐水溶液来取样肺腔。在此步骤中施加的负压最小,以防止气道塌陷。收集后,应进一步处理获得的BAL,以流式细胞计数法细胞计数和鉴定细胞。
BAL是一种有用的技术,以获得细胞学和生物化学信息响应于感染或药物。最初,BAL用于管理从光气中毒3的人类患者的分泌过多粘液。如今,该技术在人类中用于研究肺发病机理,诊断,和疾病3,24治疗管理。在动物实验中,BAL通常用于监测发生在肺气道1,2炎症应答,免疫机制,以及感染性疾病的进程。
为了研究在呼吸系统疾病模型中的炎症细胞的图案,BAL之后应绝对和差分细胞计数。除了绝对细胞数量,相对细胞数量也是令人感兴趣的。例如,维修和癌症模型显示vERY小到无BAL细胞计数升高。在此模型中,细胞组合物的评估是有用的。通过使用细胞染色,在光学显微镜组合,不同的细胞类型,例如嗜酸性粒细胞,嗜中性粒细胞,巨噬细胞和淋巴细胞,可以基于形态25,26,27,28,29,30确定。流式细胞术可用于特定评估,如识别不同的T细胞表型7,31。除了不同的浸润细胞群的鉴定,肺的非细胞组合物可以使用BAL进行调查。方法,如ELISA,免疫印迹,细胞因子微球阵列,免疫组织化学和定量聚合酶链反应是在BAL流体执行,以确定细胞因子,生长因素和其他炎症成分。为了确定肺损伤,BAL液中的总蛋白和乳酸脱氢酶水平也可以被测量32,33 。
随着新的诊断工具的发展,BAL组件的基因组和蛋白质组学特征将在不久的将来成为可能。扩展计算能力和高通量基因表达技术的组合将使得可以定义各种疾病状态的具体基因表达谱。在BAL液上进行这些技术可以提供基因和蛋白质表达模式,以确定参与肺部疾病不同阶段的重要分子。
从BAL流体获得的数据的主要限制是不同研究试验之间缺乏可比性3,9。有很高的程度灌洗技术的变异性和随后的BAL液处理。为了能够比较每个BAL试验,有必要标准化灌注的灌洗液的类型,滴注部位和细胞和非细胞组成要分析的部分。不同试验之间灌洗部分数量存在显着差异,从1到14倍34,35,36不等。这种差异可能对肺中估计的总细胞数有影响。重要的是要知道哪个BAL液体馏分含有大部分的细胞。宋等显示细胞总数约70%以1至3分之22进行检索。然而,其他报告表明,第二次灌洗液比第一次灌洗液中含有更多的细胞37,38 </sup>。我们可以从这些研究得出结论,只有一个部分的灌洗不代表整个肺,导致结果的误解。
BAL液的非细胞组成包含有关33,39,40肺部健康状况的有价值信息。 BAL液稀释的变化有助于可溶性级分的定量差异,从而导致试验结果差异。宋等比较每个灌洗部分的蛋白质和乳酸脱氢酶水平,并得出结论,第一次灌洗部分含有比第二部分多2-3倍。
要检索代表性的BAL样品进行分析,一些技术考虑是至关重要的。其中一个是进行适当的麻醉。检查脚参数非常重要鼠标的lex,以确保终端镇静。这不仅对道德原因很重要,而且因为如果鼠标没有被适当地麻醉,那么难以将导管放置并保持在正确的位置。
第二个重要的技术问题是导管在气管中的位置。当导管插入太深时,可能会损伤肺结构。在BAL过程中,导管的远端不应到达肺部。导管也应稳定并用棉线捆扎。如果导管不稳定,注射的盐水溶液可能向上流入鼻腔而不是向下流入肺。在注射和吸入盐水溶液时,保持导管是很重要的。
从BAL液获得的数据必须代表整个鼠肺。因此,重要的是滴入足够量的盐水缓冲液( 即3mL,分3份,每份1mL)。细胞产量与BAL液产量之间没有线性关系。在按摩老鼠胸部时轻轻收集溶液是重要的。如果剪切力太强,气道和BAL液中的细胞的活力,功能和结构可能会受到影响。如果吸入的液体在注射器中不可见,请小心地将导管在气管中更深或更高地移动。
应特别注意BAL处理和分析的具体方面。这将最大化BAL样本中保留的信息。在BAL之后,细胞处于营养不良的盐水介质中。因此,在BAL采样后1 h内处理样品非常重要。如果需要长时间的储存,则需要使用补充营养的培养基。
为了保持细胞活力,避免促进细胞粘附于表面的管。避免ce在有可能损害细胞的完整性,或防止所检索的BAL细胞的均匀悬浮速度细胞悬浮液的ntrifugation。 BAL含有流体细胞应在400×g下在4℃下进行7分钟进行离心。重要的是要记住,细胞悬浮液应在4℃下处理期间举行是很重要的。
The authors have nothing to disclose.
左心室肥厚是在根特大学生物医学系的分子生物学研究助理。 ERJ由UniVacFlu支持,授权号607690. KR由EC-FP7项目FLUNIVAC支持。
balanced salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
ethyleendiaminetetra acetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
23G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0,60 x 30 mm |
26G x 1/2 neelde | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0,45*12 mm |
plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023") O.D. .965 mm (0.38") 30.5m (100') |
sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
1ml syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | non pyrogenic and non toxic |
Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
centrifuge tube 50 ml | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
centrifuge tube 15 ml | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
microcentrifuge tube 1,5 ml | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile filtered |
live/dead -efluor506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
flow cytometer | BD Biosciences | ||
catheter | BD Biosciences | 393202 |