Een inrichting voor het uitvoeren van celmigratie / wondgenezing in een 96-putjesplaat
Summary
Hier presenteren we een protocol bij een semi-high throughput celmigratie analyse uit te voeren op een 96-well celcultuur plaat. Dit protocol is een snelle, eenvoudige en economische methode om consistente kras wonden op een cel monolaag te creëren.
Abstract
De celmigratie / verwonden assay is een veelgebruikte werkwijze om celmigratie en andere biologische processen zoals angiogenese en tumormetastase bestuderen. In deze assay worden cellen gekweekt tot een confluente monolaag te vormen en een mechanische wond door krassen met een inrichting. Vervolgens de migratie snelheid van de cellen naar het blootgelegde gebied kan worden gevolgd door beeldvorming. De 8-kanaals mechanische wounder is ontworpen om de meeste van de problemen bij de celmigratie assay pakken. Ten eerste kunnen onze wounder gemakkelijk worden gesteriliseerd door autoclaveren of gewone ontsmettingsmiddelen. In de tweede plaats, laat de individuele verstelbare pinnen zelfs contact op met de celkweek plaat zodat scherpe en reproduceerbare wonden kunnen worden gemaakt. Ten derde, de geleidingsstaven aan beide zijden van de wounder consistente verwonding positie in elk putje. Het gebruik van wegwerp plastic pipet tips voor het verwonden kunnen verder betere hantering van de wounder en cross-contaminat minimaliserenion. Concluderend kan onze mobiele wounder onderzoekers met gebruiksvriendelijke en reproduceerbare inrichting voor het uitvoeren van de celmigratie assay met behulp van de standaard 96-well kweekplaat.
Introduction
Celmigratie speelt een belangrijke rol in de cellulaire processen zoals embryogenese, neurogenese, angiogenese, wondheling, mucosale reparatie, epitheliale-mesenchymale-overgangen in normale ontwikkeling en ziekte situatie 1. Het is een ingewikkeld proces waarbij de coördinatie van een groot aantal inter- en intra-cellulaire evenementen, waaronder signalering molecuul interacties, cel polarisatie, cytoskelet reorganisatie matrix remodeling, membraan uitsteeksel en dynamische cel-cel adhesie modulatie 2 gaat. Door het bestuderen van celmigratie, kan de ontdekking en validatie van chemicaliën of biomoleculen leidt tot cel beweging en de bijbehorende biochemische pathways worden bepaald. Deze fundamentele werkwijze kan met voordeel worden gebruikt als indicatie voor diverse toepassingen, zoals behandeling van ziekten en drug targeting.
Het verwonden assay is een van de celmigratie assays 3. Hier wordt eenindividueel monster van cellen wordt deels mechanisch verwijderd worden om een ontbloot waar cellen migreren naar het gebied te dekken te produceren. Het percentage herstel op een bepaald tijdstip wordt gecontroleerd. Bij het hanteren groot aantal monsters, kan kwesties zoals de experimentele kosten en kruisbesmetting binnen monsters problematisch zijn. Hoewel vele commerciële instrumenten en testen beschikbaar voor het bestuderen celmigratie 4, 5, 6, velen vereist kostbare en geavanceerde apparatuur en verbeteringen zijn nog steeds nodig. Om deze redenen is een 8-kanaals mechanische cel wounder (figuur 1) ontwikkeld.
De 8-kanaals mechanische cel wounder heeft een aantal unieke kenmerken opgenomen in het oplossen van de bovengenoemde problemen. Het biedt de flexibiliteit om cel migratie uit te voeren / verwonden assays in de 96-well cultuur plaat formaat. De verstelbare guIding bar ontwerp zorgt ervoor dat de kras gebied is in de centrale positie van elk putje. Ook kan de hoogte van de geleidingsstaven worden aangepast zodat de wounder geldt voor verschillende merken van kweekplaten. Tot slot, de verstelbare verwonding pin ontwerp maakt een gelijkmatige contact van de pipetpunten met de cultuur plaat oppervlak om gelijktijdige en reproduceerbare verwonden 7, 8 te bereiken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze cel wounder heeft een aantal unieke functies in het oplossen van de problemen van de traditionele celmigratie assays. De 8-kanaals mechanische cel wounder is gemaakt van hoogwaardig roestvrij staal (staal 304) met een lange levensduur die kan worden gesteriliseerd in een autoclaaf. Bijna alle commerciële merken van 96 putjes op de markt kan worden gebruikt met deze mechanische cel wounder vanwege de verstelbare geleidingsstaaf. Het ontwerp van de verstelbare geleiding balk zorgt er ook voor dat de scharrelruimte i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag aan de heer Tam Po Leung, de heer Wong Chi Kin en de technische staf van de FNWI Workshop, Hong Kong Baptist University, om hun technische vaardigheden en advies te bedanken bij het maken van het prototype van deze wounder.
Materials
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
Riferimenti
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A., Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980 (2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
