Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba

Summary

Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per la produzione di chip microfluidici e la configurazione degli esperimenti microfluidici per misurare la durata di vita e fenotipi cellulari delle singole cellule di lievito.

Abstract

Il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae è un importante organismo modello nella ricerca sull'invecchiamento. Gli studi genetici hanno rivelato molti geni con effetti conservati sulla durata della vita in tutte le specie. Tuttavia, le cause molecolari dell'invecchiamento e della morte rimangono sfuggenti. Per ottenere una comprensione sistematica dei meccanismi molecolari alla base dell'invecchiamento del lievito, abbiamo bisogno di metodi ad alto rendimento per misurare la durata della vita e quantificare vari fenotipi cellulari e molecolari in singole cellule. In precedenza, abbiamo sviluppato dispositivi microfluidici per tracciare le cellule madri di lievito in erba per tutta la loro durata di vita, eliminando le cellule figlie appena nate. Questo articolo presenta un metodo per la preparazione di chip microfluidici e per l'impostazione di esperimenti microfluidici. È possibile utilizzare più canali per tracciare contemporaneamente le cellule in condizioni diverse o da diversi ceppi di lievito. Una configurazione tipica può tracciare centinaia di cellule per canale e consentire l'imaging al microscopio ad alta risoluzione per tutta la durata della vita delle cellule. Il nostro metodo consente anche una caratterizzazione dettagliata della durata della vita, dei marcatori molecolari, della morfologia cellulare e della dinamica del ciclo cellulare delle singole cellule. Inoltre, il nostro dispositivo microfluidico è in grado di intrappolare una quantità significativa di cellule madri fresche che possono essere identificate mediante analisi delle immagini a valle, rendendo possibile misurare la durata della vita con maggiore precisione.

Introduction

Erba lievito è un potente organismo modello nella ricerca sull'invecchiamento. Tuttavia, un test di durata della vita convenzionale nel lievito si basa su microdissezione, che non è solo lavoro intensivo, ma anche a basso throughput di ^{1, 2.} Inoltre, l'approccio tradizionale microdissezione non fornisce una vista dettagliata di varie caratteristiche cellulari e molecolari nelle cellule madri singole che invecchiano. Lo sviluppo di dispositivi microfluidici ha permesso una procedura automatizzata per misurare durata lievito nonché a seguire marcatori molecolari e diversi fenotipi cellulari per tutta la....

Protocol

1. Silicon Wafer Mold Fabrication

NOTA: La fotomaschera è stato progettato con il software AutoCAD e prodotto da una società commerciale. Questo disegno contiene tre strati di diversi modelli ( File supplementare 1 ). Le altezze di primo, secondo, e terzo strato sono circa 4 pm, 10 pm e 50 um, rispettivamente. Lo stampo wafer di silicio è stata creata dalla fotomaschera mediante litografia soft ^{9, 10.}

1. Cuocere un wafer di silicio a 200 ° C per 10 minuti per evaporare il vapore acqueo. cappotto ....

Results

Dopo gli esperimenti, le durate di vita di cellule e molti fenotipi cellulari e molecolari possono essere estratti dalle immagini time-lapse registrate. Poiché ci sono un certo numero di diverse caratteristiche che possono essere estratti da ciascuna cella, il primo passo dell'analisi è di annotare le cellule ed eventi, tra le posizioni ei confini delle celle e la tempistica dei vari eventi che vengono monitorati, quali come gli eventi in erba. Queste annotazioni che renderà più facile p.......

Discussion

Il dispositivo PDMS deve essere preparata. Altrimenti, le bolle d'aria causate inserendo tubi nel dispositivo saranno difficili da rimuovere. Fase 3.4 è importante per migliorare l'efficienza di carico delle cellule concentrando le cellule. Per aumentare la velocità dell'esperimento, da 4 a 6 moduli sullo stesso chip PDMS collegati a pompe indipendentemente operativi sono tipicamente utilizzati per eseguire 4 a 6 diversi esperimenti (ceppi diversi o composizioni media) simultaneamente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'' < Wafer di silicio 111>	Addison Engineering
SU-8 Serie 2000 e 3000	MicroChem
Sylgard® 184	ellsworth	2065622	Include la base di elastomero siliconico Sylgard® e l'agente indurente piastre
Petri	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (D.I. 0,75 mm)	Sigma-Aldrich
24 mm x 40 mm Vetro di copertura SLIP-RITE®	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch	Tape ULINE	S-10223
VWR® Lamette da barba	VWR	55411-050
etanolo puro, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
Siringa BD da 5 ml (Luer-Lock™ Suggerimento)	Becton, Dickinson and Company	309646
Tubi a parete standard in PTFE (100 piedi, dimensioni AWG: 22, ID nominale: 0,028)	Azienda di fornitura di componenti	SWTT-22
Assortimento di aghi Azienda	di fornitura di componenti	NEKIT-1
Essiccatore	HACH	2238300
Forno da laboratorio	Fisher Scientific	13246516GAQ
Microscopio Nikon TE2000 con obiettivo 40X e 60X	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 con obiettivo 40X e 60X	siringa Zeiss
	Longerpump	TS-1B