Microfluidic उपकरणों का उपयोग करते हुए एकल नवोदित खमीर कोशिकाओं में जीवनकाल और सेलुलर समलक्षणियों की माप के लिए
Summary
यह लेख एक प्रोटोकॉल microfluidic चिप्स के उत्पादन और microfluidic प्रयोगों की स्थापना के जीवन काल और एकल खमीर कोशिकाओं के सेलुलर समलक्षणियों को मापने के लिए के लिए अनुकूलित प्रस्तुत करता है।
Abstract
Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.
Introduction
नवोदित खमीर अनुसंधान उम्र बढ़ने में एक शक्तिशाली मॉडल जीव है। हालांकि, खमीर में एक पारंपरिक जीवन काल परख सूक्षम पर निर्भर करता है, जो न केवल श्रम गहन लेकिन यह भी कम प्रवाह क्षमता 1, 2 है। इसके अलावा, पारंपरिक सूक्षम दृष्टिकोण अकेली मां कोशिकाओं में विभिन्न सेलुलर और आणविक सुविधाओं का एक विस्तृत विवरण प्रदान नहीं करता है उनकी उम्र बढ़ने के। Microfluidic उपकरणों के विकास के खमीर उम्र को मापने के लिए और साथ ही मां कोशिकाओं 3, 4, 5, 6, 7, 8 की उम्र भर आणविक मार्कर और विभिन्न सेलुलर समलक्षणियों पालन करने के लिए एक स्वचालित प्रक्रिया में सक्षम बनाया है। बाद खमीर कोशिकाओं एक microfluidic युक्ति में लोड कर रहे हैं, वे स्वत: समय-लैप का उपयोग कर एक खुर्दबीन के नीचे ट्रैक किया जा सकताई इमेजिंग। प्रसंस्करण उपकरण इमेजिंग की मदद से, विभिन्न सेलुलर और आणविक समलक्षणियों 3 निकाला जा सकता है, 6, 8, उम्र, आकार, फ्लोरोसेंट संवाददाता, सेल आकृति विज्ञान, कोशिका चक्र की गतिशीलता, आदि, जिनमें से कई मुश्किल या असंभव का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं सहित पारंपरिक सूक्षम विधि। Microfluidic उपकरणों कुछ साल पहले 3, 4, 6, 7 उनके सफल विकास के बाद से खमीर उम्र बढ़ने अनुसंधान के क्षेत्र में प्रसिद्धि प्राप्त की है। कई समूह बाद में पहले डिजाइन 5 के रूपांतरों पर प्रकाशित किया है, और कई खमीर प्रयोगशालाओं उनके अध्ययन के लिए microfluidic उपकरणों कार्यरत हैं।
एक सेल संस्कृति घातीय वृद्धि के दौर से गुजर में, वृद्ध मां कोशिकाओं है कि अवलोकन के लिए उपलब्ध हैं की संख्या miniscu हैle। इसलिए, उम्र मापन के लिए microfluidic डिवाइस के सामान्य डिजाइन सिद्धांत मां कोशिकाओं बनाए रखने के लिए और बेटी की कोशिकाओं को हटाने के लिए है। ऐसा ही एक डिजाइन तथ्य यह है कि खमीर असममित कोशिका विभाजन से होकर गुजरती है का उपयोग करता है। डिवाइस इच्छा जाल बड़ा मां कोशिकाओं में संरचनाओं और अनुमति देने के छोटे बेटी कोशिकाओं धुल जाने। Microfluidic चिप इस आलेख में वर्णित जाल मां कोशिकाओं को एक नरम polydimethylsiloxane (PDMS) पैड (ऊर्ध्वाधर लटकता हुआ कॉलम) (चित्रा 1) का उपयोग करता है। इसी तरह की डिजाइन की डिवाइस पहले से 3, 4, 6, 7 की जानकारी मिली है। यह प्रोटोकॉल microfluidic उपकरणों और एक सीधा सेल लोडिंग विधि है कि समय-अंतराल इमेजिंग प्रयोगों के लिए अनुकूलित है निर्माण करने के लिए एक सरल प्रक्रिया का उपयोग करता। microfluidic युक्ति में महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक PDMS जाल मां कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया पैड की चौड़ाई है। हमारे घevice व्यापक पैड कि प्रत्येक पैड के तहत और अधिक मां कोशिकाओं रख सकते हैं, ताजा मां कोशिकाओं है कि उनके जीवन भर ट्रैक किया जा सकता का एक महत्वपूर्ण अंश सहित उपयोग करता है। उम्र माप के अलावा, इस प्रोटोकॉल एकल कक्ष समय-अंतराल इमेजिंग प्रयोगों के लिए उपयोगी जब कोशिकाओं कई पीढ़ियों या जब पूरे जीवन भर एक अवलोकन के लिए आवश्यक है के लिए नज़र रखी जा करने की आवश्यकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMS डिवाइस हाल में किए जाने की जरूरत है। अन्यथा, हवा के बुलबुले डिवाइस में ट्यूब डालने की वजह से दूर करने के लिए कठिन हो जाएगा। चरण 3.4 कोशिकाओं ध्यान केंद्रित करके सेल लोड हो रहा है दक्षता में सुधार के लिए म…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.
Materials
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch(I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| PURE ETHANOL, KOPTEC | VWR | 64-17-5 | |
| WHOOSH-DUSTER™ | VWR | 16650-027 | |
| 5mL BD Syringe (Luer-Lock™Tip) | Becton, Dickinson and Company. | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028) | COMPONENT SUPPLY COMPANY | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | COMPONENT SUPPLY COMPANY | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | FISHER SCIENTIFIC | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
Riferimenti
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