L'uso di un'analisi di β-lactamase-based conduttimetriche biosensore per rilevare interazioni biomolecolari

Sommario

In questo lavoro, segnaliamo un nuovo metodo per studiare le interazioni proteina-proteina usando un biosensore conduttimetriche basato sulla tecnologia ibrida β-lattamasi. Questo metodo si basa sul rilascio di protoni all'idrolisi di β-lattami.

Abstract

Biosensori stanno diventando sempre più importante e implementata in vari campi quali rilevamento del patogeno, diagnosi molecolare, monitoraggio ambientale e controllo della sicurezza alimentare. In questo contesto, abbiamo usato il β-lattamasi come enzimi reporter efficiente in diversi studi di interazione proteina-proteina. Loro capacità di accettare gli inserimenti di peptidi o proteine/domini strutturati fortemente incoraggia inoltre l'uso di questi enzimi per generare proteine chimeriche. In uno studio recente, abbiamo inserito un frammento di anticorpo di singolo dominio il Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase. Questi piccoli domini, chiamati anche nanobodies, sono definiti come i domini di antigene-leganti degli anticorpi di singola catena da camelidi. Come comune doppia catena anticorpi, essi mostrano elevata affinità e specificità per i loro obiettivi. La proteina chimerica risultante ha esibito un'alta affinità contro il bersaglio mantenendo l'attività β-lattamasi. Ciò suggerisce che le moiety nanobody e β-lactamase rimangono funzionali. Nel lavoro attuale, segnaliamo un protocollo dettagliato che combina il nostro sistema di β-lactamase ibrido per la tecnologia dei biosensori. Il grippaggio specifico di nanobody al suo target può essere rilevato grazie a una misurazione conduttimetriche dei protoni rilasciato dall'attività catalitica dell'enzima.

Introduzione

Biosensori sono dispositivi analitici che combinano un'interazione bio-molecolari con dispositivi di segnalazione fisiche o chimiche denominate trasduttori¹. Segnali registrati possono quindi essere interpretati e convertiti per monitorare le interazioni tra i partner immobilizzati e gratuiti. La maggior parte dei biosensori implicano l'uso di un anticorpo per rilevare analiti come ormoni o agente patogeno differente marcatori². Formati di sensore diverso possono essere utilizzati e includono biosensori basati su massa, magnetici, ottici o elettrochimici. Quest'ultimo è tra i più comuni sensori utilizzati e funzione di c....

Protocollo

1. preparazione del campione proteina

1. Produrre e purificare la proteina ibrida BlaP-cabina-Lys3 come riportato nel nostro precedente studio¹⁵. Memorizzare la proteina in 50 mM tampone fosfato pH 7.4 con la seguente composizione: 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na₂HPO₄ e 0,24 g di KH₂PO₄ disciolto in 800 mL di acqua distillata difficoltà il pH della soluzione a 7.4 prima regolazione del volume finale della soluzione a 1 L. filtro sterilizzare la soluzione della proteina.
2. Preparare una soluzione stock di gallina albume lisozima (HEWL). Sciogliere 100 mg (40.000 unità/mg) di HEWL....

Risultati

Design e ingegneria della proteina chimerica BlaP-cabina-Lys3

Figura 1 rappresenta l'inserimento di cabina-Lys3 in un ciclo permissivo della BalP classe A β-lactamase da Bacillus licheniformis. L'inserimento è stato effettuato fra i residui Asp198 e Lys199. Un sito di clivaggio della trombina è stata introdotta su ciascun lato della cabina-Lys3. Cellule trasformate con un plasmide di espressione costitutiva che codifica pe.......

Discussione

In questo lavoro presentiamo un metodo per funzionalizzare un nanobody utilizzando il β-lactamase BlaP come una proteina carrier e mostriamo che possiamo implementare con successo la proteina ibrida risultante in un'analisi di sensore potenziometrico. L'aspetto di innovazione principale del nostro lavoro rispetto ad altri dosaggi di biosensore è l'accoppiamento covalente della parte dell'anticorpo per l'attività enzimatica che genera il segnale elettrico. Questa tecnologia di inserimento della cosiddetta proteina present.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
KH2PO4	Sigma-Aldricht	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldricht	1551128
NaCl	Sigma-Aldricht	S7653
Tris– HCl	Roche	10812846001
EDTA	Sigma-Aldricht	E9884
KCl	Sigma-Aldricht	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldricht	NIST2186II
2-mercaptoetanolo	Sigma-Aldricht	M6250
alanina	Sigma-Aldricht	A7627
HClO4	Fluka	34288	1M HClO4 soluzione, distributore : Sigma-Aldricht
caseina idrolizzato	Sigma-Aldricht	22090
benzilpenicillina sodica	Sigma-Aldricht	B0900000
lisozima albume d'uovo di gallina	Roche	10837059001
eptano	Sigma-Aldricht	246654
metanolo	Sigma-Aldricht	322415
soluzione di idrossido di ammonio	Sigma-Aldricht 380539		28% NH3  in H2O, purificato mediante doppia distillazione (concentrato?)
Materiali di consumo da laboratorio
Piastra a 6 pozzetti	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6 pozzetti Piastra
EquipmentMisuratore di
pH	WTW	1AA110	Misuratore di pH da laboratorio inoLab pH 7110
Sistema di vuoto e filtrazione	Nalgene	NALG300-4100	Portafiltri con ricevitore, distributore:
chip			prodotti da Yunus e colleghi (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		fuori produzione, successore Autolab PGSTAT302N
multimetro digitale, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		fuori produzione, successore Metrahit Base

sensore potenziometrico VWR