В этой работе мы приводим новый метод для изучения взаимодействия протеин протеина, с помощью conductimetric биосенсор на основе гибридной технологии β-лактамаз. Этот метод полагается на выпуск протонов после гидролиза β-лактамы.
Биодатчики становятся все более важным и реализованных в различных областях, таких как обнаружение возбудителя, молекулярной диагностики, мониторинга окружающей среды и продовольственной безопасности управления. В этом контексте мы использовали β-лактамаз как эффективный репортер ферментов в нескольких исследованиях взаимодействия протеин протеина. Кроме того их способность принимать вставки пептидов или структурированные белки/домены решительно поощряет использование этих ферментов для создания химерных белков. В недавнем исследовании мы вставлен фрагмент одного домена антитела в Bacillus licheniformis я β-лактамаз. Эти небольшие доменов, также называемые nanobodies, определяются как антиген связывая доменов одной цепи антител от верблюдовых. Как общие антитела двойной цепи они показывают, высокой работоспособностью и специфики для их целей. Результате химерных белка выставлены высоким сродством против цели при сохранении активности β-лактамаз. Это свидетельствует о том, что наночастицы и β-лактамаз постановление остаются функциональными. В настоящей работе мы доклад подробный протокол, который сочетает в себе наш гибридной системы β-лактамаз биосенсор технологии. Конкретные привязки наночастицы своей цели могут быть обнаружены благодаря conductimetric измерение протонов, выпущенное каталитической активности фермента.
Биодатчики, аналитических приборов, которые сочетают био молекулярная взаимодействия с физическими или химическими сигнализаторы, именуемый преобразователи1. Записанные сигналы можно затем интерпретировать и преобразованы в контролировать взаимодействие между партнерами, подвижности и бесплатные. Большинство биодатчиков используют антитела для обнаружения аналитов, например гормоны или маркеры различных патогена2. Датчик различные форматы могут быть использованы и включают на основе массы, магнитных, оптических или электрохимические биодатчиков. Последние относятся к числу наиболее часто используемых датчиков и функции путем преобразования привязки событий в электрический сигнал. Выступления и чувства всех биосенсоры на основе антител сильно зависит по сути два параметра: i) качество антитела и ii) свойства системы, используется для генерации сигнала2.
Антитела являются высокой молекулярной массы димерной белки (150 – 160 кДа), которые состоят из двух легких цепей и двух тяжелых цепей. Взаимодействие между легкими и тяжелыми цепями основном стабилизирована гидрофобных взаимодействий, а также сохранены дисульфидными облигаций. Каждая цепь включает переменной домен, взаимодействующий с антигеном по существу через три гипервариабельных регионов, названный взаимодополняющих определения регионов (CDR1-2-3). Несмотря на многочисленные достижения в этой области, крупномасштабные выражение полнометражного антител с лоу кост выражение системами (например, кишечной палочки) часто приводит к производству нестабильных и агрегированных белков. Именно поэтому различные фрагменты антител разработаны такие как сингл цепь переменной фрагменты3 (ScFvs ≈ 25 кДа). Они состоят из переменной доменов соответственно один из тяжелых и один легкие цепи, которые связаны ковалентно синтетических аминокислотной последовательности. Однако эти фрагменты часто отображения бедных стабильности и имеют тенденцию к совокупности, поскольку они предоставляют большую часть их гидрофобные регионах растворителя4. В этом контексте одной цепи верблюдовые фрагментов антитела, называют nanobodies или VHHs, похоже отличные альтернативы ScFvs. Эти домены соответствуют переменной домены верблюдовые сингл цепь антител. В отличие от обычных антитела антитела верблюдовые лишены легких цепей и содержать только две тяжелые цепи5. Таким образом nanobodies являются наименьшей мономерных антитела фрагменты (12 кДа) способны связывать к антигену с сродство похож на обычного антитела6. Кроме того они представляют, улучшена стабильность и растворимость, по сравнению с другими полнометражного антител или фрагментов антитела. Наконец их малых размеров и их расширенные петли CDR3 позволяют им признать загадочные эпитопов и привязка к фермента активных сайтов7,8. В настоящее время эти домены получают значительное внимание и были объединены в биосенсор технологии. Например, Хуан и др. разработали на основе наночастицы биосенсора для обнаружения и количественного определения человека простат специфический антиген (PSA)9.
Как упоминалось выше важным параметром в анализов биодатчик является эффективность системы, используемая для создания электрического сигнала. По этой причине на основе ферментов электрохимических биодатчики привлекают все большее внимание и широко используются для различных приложений таких, как здравоохранение, продовольственная безопасность и мониторинг окружающей среды. Эти биодатчики полагаются на каталитического гидролиза субстрата ферментом для генерации электрического сигнала. В этом контексте чтобы быть более конкретным, более чувствительную и легче реализовать, чем многие другие ферменты, такие как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена10экспериментально были показаны β-лактамаз. Β-лактамаз являются ферменты, которые отвечают за бактериальной резистентности к β-лактамные антибиотики, ГТФ их. Они являются мономерных, очень стабильных, эффективных и небольших размеров. Кроме того домен/пептид вставок в β-лактамаз генерировать Би функциональные химерных белки, которые оказались эффективными инструментами для изучения взаимодействий протеин лиганд. Действительно недавние исследования показали что включение переменной фрагментов антитела в результаты β-лактамаз ТЭМ1 в химерных белок, который по-прежнему способны связывать с высоким сродством к своей целевой антигена. Интересно, что было показано антиген-связывая побудить аллостерический регулирование ТЭМ1 каталитической активности11,12. Кроме того мы показали в нескольких исследованиях вставки домен белка в разрешительной петлю Bacillus licheniformis я β-лактамаз создает функциональные химерных белки, которые хорошо подходят для отслеживания взаимодействий протеин лиганд13 ,14. Мы недавно вставлены наночастицы, названный кабины Lys3, в этом разрешительной вставки сайт я15. Этот наночастицы было показано для привязки к курица яичного белка лизоцима (HEWL) и подавлять свою ферментативную активность16. Мы показали, что созданные гибридный белок, именем я такси Lys3, сохраняется высокая специфичность / сродство против HEWL в то время как активность β-лактамаз оставалась без изменений. Затем мы успешно объединены β-лактамаз гибридные технологии электрохимический биодатчик и показал, что количество создаваемых электрического сигнала зависит от взаимодействия между я такси Lys3 и HEWL, иммобилизованных на электрод. Действительно гидролиз β-лактамные антибиотики, я индуцирует Протон выпуска, который может быть преобразован в количественных Электрический сигнал. Эта комбинация гибридной технологии β-лактамаз с электрохимический биодатчик быстро, чувствительных, количественных и позволяет в реальном времени измерения генерируемого сигнала. Эта методология описана здесь.
В этой работе мы представляем метод functionalize наночастицы, используя я β-лактамаз как перевозчика белка и мы показываем, что мы можем успешно реализовать полученный гибридного белка в assay потенциометрических датчиков. Главное нововведение аспект нашей работы, по сравнению с другими биос?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают, Валлонский регион Бельгия в рамках исследовательских проектов SENSOTEM и NANOTIC, а также национальные фонды для научных исследований (Ричмонд-F.N.R.S) за их финансовую поддержку.
Reagents | |||
KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
Laboratory consumables | |||
6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
Equipment | |||
pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |