Enzym-basierte Biosensoren Mit Tonic und Phasic Glutamate in der Alzheimer-Maus-Modellen zu messen
Summary
Hier beschreiben wir die Setup – Software Navigation, und die Datenanalyse für eine räumlich und zeitlich genaue Methode der tonischen und phasische extrazellulären Glutamat Veränderungen in vivo Messung unter Verwendung von enzymgekoppelten Mikroelektrodenarrays (MEA).
Abstract
Neurotransmitters Störung ist oft ein wichtiger Bestandteil von Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), eine Rolle in der Pathologie spielen Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Depression und Angst zu Grunde liegen. Traditionell wurde, Mikrodialyse die häufigste (gelobt) -Technik Neurotransmitter Veränderungen zu untersuchen, die bei diesen Erkrankungen auftreten. Aber weil die Mikrodialyse die Fähigkeit hat, langsam 1-20 Minuten Änderungen über große Bereiche des Gewebes zu messen, hat es den Nachteil, Invasivität, potentiell zerstörte intrinsische Verbindungen im Gehirn und eine langsame Sampling-Fähigkeit. Eine relativ neuere Technik, die Mikroelektroden-Anordnung (MEA), hat zahlreiche Vorteile für die in diskreten Gehirnbereichen spezifische Neurotransmitterveränderungen messen, wie sie auftreten, so dass für eine räumlich und zeitlich präzise Annäherung. Zusätzlich MEAs unter Verwendung minimal – invasiver ist, so dass zur Messung von Veränderungen Neurotransmitter in vivo. In unserem Labor ha wirve speziell interessiert an Veränderungen des Neurotransmitters Glutamat, im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit Pathologie gewesen. Als solches hier beschriebene Verfahren wurde verwendet, um in Glutamat in einem transgenen Mausmodell der Alzheimer-Krankheit mögliche Hippocampus-Störungen zu beurteilen. Kurz gesagt, verwendet das Verfahren mit einem Enzym, einem Multi-Site-Mikroelektrode beinhaltet das Beschichten sehr selektiv für den Neurotransmitter von Interesse und unter Verwendung von sich selbst verweisende Seiten Hintergrundrauschen und Interferenten zu subtrahieren. Nach der Plattierung und die Kalibrierung kann die MEA mit einer Mikropipette ausgebildet sein und abgesenkt in die Hirnregion von Interesse einer stereotaxische Vorrichtung. Hier beschriebene Verfahren RTG (TauP301L) 4510-Mäuse anästhesiert und beinhaltet eine stereotaxische Vorrichtung unter Verwendung genau Subregionen (DG, CA1 und CA3) des Hippocampus zielen.
Introduction
Mess Neurotransmitter Veränderungen im Gehirn ist ein wichtiges Instrument für Neurowissenschaftler Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), die oft gekennzeichnet durch Neurotransmitter Dysregulation studieren. Obwohl die Mikrodialyse in Verbindung mit Hochdruck – Flüssigkeitschromatographie (HPLC / EC) die am weitesten verbreitete Methode zur Messung der Veränderungen in der extrazellulären Neurotransmitter Stufen 1, 2 war, 3, 4, kann die räumliche und zeitliche Auflösung von Mikrodialysesonden nicht ideal für Neurotransmitter , wie Glutamat, die 6 in dem extrazellulären Raum 5, streng reguliert werden. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Genetik und Bildgebung, gibt es weitere Verfahren , die verwendet werden können , Glutamat in vivo abzubilden. Verwendung von genetisch kodierten Glutamat fluoreszierende Reporter (iGluSnFR) eind Zwei-Photonen – Bildgebung, die Forscher in der Lage , Glutamat – Freisetzung sowohl von Neuronen und Astrocyten in vitro zu visualisieren und in vivo 7, 8, 9. Bemerkenswert ist, ermöglicht dies aus einem größeren Sichtfeld der Aufnahme und nicht die inneren Verbindungen des Gehirns stören. Während diese neuen optischen Techniken zur Visualisierung von Glutamat Kinetik und Messung von sensorisch evozierte Reaktionen und neuronale Aktivität ermöglichen, fehlt ihnen die Fähigkeit, die Menge an Glutamat in den extrazellulären Raum in diskreten Gehirnregionen zu quantifizieren.
Ein alternatives Verfahren ist die Enzym-gebundenen Mikroelektroden-Anordnung (MEA), die selektiv extrazellulärem Neurotransmitter Ebene, wie Glutamat, durch die Verwendung eines selbst referenzierten Aufzeichnungsschemas messen kann. Die MEA-Technik wird verwendet, um Veränderungen in der extrazellulären Glutamat nach traumatischem Gehirn zu studieren10 Verletzungen, 11, 12, Alterung 13, 14, Stress 15, 16, Epilepsie 17, 18, Alzheimer-Krankheit 19, 20, und die Injektion eines viralen mimic 21 und stellen eine Verbesserung gegenüber den räumlichen und zeitlichen Beschränkungen , die in Mikrodialyse. Während Mikrodialyse die Fähigkeit , in der Nähe der Synapse zu messen einschränkt 22, 23, MEAs hat eine hohe räumliche Auflösung , die in der Nähe zum selektiven Maßnahmen der extrazellulären Glutamat – Spill – over ermöglicht 24 Synapsen, 25. Zweitens ist die geringe zeitliche Auflösung der Mikrodialyse (1 – 20 min) begrenzt die Fähigkeit, die untersuchenschnelle Dynamik der Glutamatfreisetzung und Clearance in Millisekunde 26 bis Sekunden – Bereich auftritt. Da Unterschiede in der Freisetzung oder Clearance von Glutamat nicht in Maßnahmen von Tonika, Ruheglutamatwert offensichtlich sein können, kann es wichtig sein, dass die Freisetzung von Glutamat und Clearance direkt gemessen werden. MEAs ermöglichen diese Maßnahmen aufgrund ihrer hohen zeitlichen Auflösung (2 Hz) und niedrigen Nachweisgrenzen (<1 uM). Drittens erlauben MEAs zur Untersuchung der subregionalen Variationen in Neurotransmittern innerhalb einer bestimmten Hirnregion, wie die Ratte oder Maus Hippocampus. Beispielsweise unter Verwendung von MEAs wir Gyrus dentatus separat ausrichten können (DG), Ammonshorn 3 (CA3) und Ammonshorn 1 (CA1) des Hippocampus, die über eine trisynaptic Schaltung 27 verbunden sind, um subregionalen Unterschiede in extrazellulären Glutamat zu untersuchen. Aufgrund der Größe der Mikrodialysesonden (1 – 4 mm Länge) und der durch Implantation verursachten Schadens 28 </ sup>, 29, sind subregionalen Unterschiede schwer zu adressieren. Außerdem werden nur die optischen Systeme Stimulation durch externe Reize, wie beispielsweise eine whisker Stimulation oder Lichtflimmern, ermöglichen die nicht subregionalen Stimulation 7 zulässt. Ein letzter Vorteil der MEAs gegenüber anderen Methoden ist die Fähigkeit , diese Subregionen in vivo zu studieren , ohne ihre äußeren und inneren Anschlüsse zu stören.
Hier beschreiben wir , wie ein Aufzeichnungssystem (beispielsweise FAST16mkIII) in Kombination mit MEAs, bestehend aus einer auf Keramik basierende Multi – Site – Mikroelektrode, kann differentiell auf den Aufzeichnungs Seiten beschichtet wird , um störende Mittel zu ermöglichen , erfaßt und von dem Analyten – Signal entfernt werden. Wir zeigen auch Diese Arrays können für Amperometrie-basierten Untersuchungen der in vivo Glutamat Vorschrift im DG, CA3 und CA1 Hippocampus – Subregionen von betäubtem RTG (TauP301L) 4510 – Mäuse, ein häufig verwendeter m verwendet werden ,ouse Modell der Alzheimer-Krankheit. Darüber hinaus stellen wir die Bestätigung der Empfindlichkeit des MEA – Systems auf der schnelle Dynamik der Glutamatfreisetzung und Freigabe durch die Mäuse , die mit Riluzol Behandlung, ein Medikament in vitro gezeigt Glutamatfreisetzung zu verringern und Glutamataufnahme 30, 31, 32, 33 zu erhöhen, und zeigt diese jeweiligen Veränderungen in vivo im Maus – Modell TauP301L.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die MEA – Technik ermöglicht die Messung von schnellen Kinetik der Freisetzung von Neurotransmittern und die Aufnahme in vitro und in vivo. Daher erzeugt die Technologie, um eine Vielzahl von Datenausgabe einschließlich tonisch Neurotransmitter Ebenen, evozierte Freisetzung von Neurotransmittern und Neurotransmitter-Clearance. Da jedoch die Verwendung von MEAs ein relativ komplexer Vorgang ist, gibt es zahlreiche Faktoren, die für den erfolgreichen Einsatz optimiert müssen werden. Beispielsweise w?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
(; U54GM104942 MNR), NIA (MNR; R15AG045812), Alzheimer-Gesellschaft Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences unterstützt (MNR; NIRG-12-242187), WVU Fakultät Forschungs Senat Grant (MNR) und WVU PSCOR Grants (MNR).
Materials
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | 782000 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
Riferimenti
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